Manual de procedimentos básicos em microbiologia



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Diagnóstico Laboratorial


A maioria das ITUs é diagnosticada através de dados clínicos e laboratoriais como piúria e ou bacteriúria e também pela urocultura com contagem de colônias.


Pesquisa da Piúria - reflete a possibilidade de resposta inflamatória do trato urinário. A causa mais comum é a infecção bacteriana que poderá ser confirmada pela urocultura; porém a piúria poderá ser evidenciada nas situações clínicas apresentadas abaixo, cuja urocultura resulta negativa.
a) Não infecciosa:

  • doença túbulo-intersticial (nefropatia por analgésicos e beta-lactâmicos)

  • cálculos e corpos estranhos

  • terapia com ciclofosfamida

  • rejeição de transplante renal

  • trauma genitourinário

  • neoplasias

  • glomerulonefrite

b) Infecciosa (microrganismos de difícil cultivo):



  • Tuberculose e infecções causadas por micobactérias atípicas

  • Haemophilus influenzae

  • Chlamydia spp. e Ureaplasma urealyticum

  • Gonococos

  • Anaeróbios

  • Fungos

  • vírus (herpes, adenovírus, varicela-zoster)

  • Leptospiras

c) Outras causas infecciosas:



  • durante ou até uma semana após o tratamento adequado da ITU

  • Infecção “mascarada” pela antibioticoterapia

  • infecções adjacentes ao trato urinário (apendicite, diverticulite e prostatite)

A pesquisa de piúria poderá ser realizada por diferentes métodos manuais e automatizados:




Métodos

Princípios

Limites de Detecção

Microscópico:

  • Gram

Reconhecimento das bactérias por características morfo-tintoriais. Gram de uma gota de urina não ccentrifugada


≥ 1 bactéria em campo de imersão

≥ 105 UFC/ml


Pesquisa de Leucócitos (urina não centrifugada):

  • lâmina e lamínula


  • câmara de contagem



  • excreção urinária de leucócitos




  • sedimento urinário

Pequeno aumento 10x

Aumento 40x

Grande aumento 100x


Contagem na câmera de

hemocitômetro


Determinação da excreção
Determinação no sedimento

30 leucócitos/campo

5 leucócitos/campo

1-2 leucócitos/campo


≥ 10 plócitos/ml (valor clínico)

≥ 400.000 leucócitos/hora


≥ 10 plócitos/ml (valor clínico)

Testes Químicos:



  • esterase leucocitária



Bactérias gram negativas reduzem Nitrato a Nitrito

Detecta a presença dessa enzima nos leucócitos

≥ 104 UFC/ml

falso neg em cocos gram + e Pseudomonas
Equivale a 5 leucócitos/campo 40x

Os testes utilizando fitas reagentes têm bom valor preditivo para afastar infecção urinária, no entanto apresentam baixo desempenho para sugerir ITU. Altas doses de vitamina C podem dar falso teste negativo para nitrito na fita, e a presença de Trichomonas pode dar teste positivo para esterase leucocitária.


Valores de Sensibilidade, especificidade e valor preditivo (VP) dos testes nitrito e esterase leucocitária, para predizer 105 UFC/ml


TESTE

Sensibilidade %

Especificidade %

VP (%) do teste positivo

VP (%) do teste negativo

Nitrito

69

90

57

94

Esterase leucocitária

71

85

47

94


Bacterioscopia de urina:

  • Com a urina não centrifugada, e apenas homogeneizada, pegar uma alça com 10 µl de urina e depositar sobre uma lâmina de vidro;

  • Deixar secar, fixar na chama e corar pelo gram.

  • Com objetiva de imersão (1000x) fazer contagem.

  • Se encontrar 1 ou mais bactérias por campo, sugere ≥ 105 UFC.

  • A presença de células epiteliais e vários tipos morfológicos de bactérias sugere contaminação.


Bacteriúria - a pesquisa de bacteriúria poderá ser realizada através da bacterioscópia da urina, testes bioquímicos e cultura de urina.

Quantificação da Bacteriúria - Contagem de Colônias

A identidade da bactéria infectante isolada na cultura de urina é um dos fatores indicativos de infecção, porém não podemos esquecer que existem microrganismos que colonizam freqüentemente a uretra distal de pacientes, e que raramente causam ITUs. Cerca de 10 a 20% das pacientes apresentam colonização da mucosa vaginal e da região periuretral por enterobactérias por esta razão, além da identificação de bactérias uropatógenas, a avaliação do número de unidades formadoras de colônias UFC por ml tornou-se um critério importante na interpretação da urocultura, já que os microrganismos colonizantes geralmente apresentam-se em contagens baixas.


O critério de diagnóstico tradicional de Kass (1956), determina a contagem ≥ 105 UFC/ml como limite indicativo de infecção urinária. Contudo, no caso de pacientes do sexo feminino apresentando infecção urinária sintomática não complicada, este limite corresponde a uma alta especificidade e uma baixa sensibilidade. De fato, cerca da terça parte das mulheres com síndrome clínica de disúria, freqüência, urgência e piúria e que melhoram com o uso de antimicrobianos, apresentam contagens entre 102 a 104 UFC/ml, segundo critério de Stamm (1982). Portanto, atualmente torna-se necessário que os laboratórios utilizem os critérios propostos por Stamm e comecem a detectar microrganismos a partir de 102 UFC/ml, principalmente nesta população de mulheres.
Comparação de Contagem de Colônias para ITU Baixa por coliformes.


Pesquisador

Urina

Sensibilidade

Especificidade

Valor Preditivo

Positivo

Negativo

Stamm (1982)

≥ 102 coliformes/ml

0.95

0.85

0.88

0.94

Kass (1956)

≥ 105 coliformes/ml

0.51

0.99

0.98

0.65

O resultado da urocultura deverá ser avaliado juntamente com os outros dados laboratoriais (pesquisa de bacteriúria e/ou piúria) e clínicos (presença ou ausência de sintomas, fatores predisponentes, população de risco, etc.). Considerando-se que as amostras de urina submetidas a cultura são provenientes de pacientes com sintomas de ITU e de pacientes assintomáticos com alto risco de Infecção.


Apresentamos na tabela seguinte os diversos métodos utilizados para a quantificação da urina e posterior identificação e antibiograma.

Parâmetros para interpretação das uroculturas


Parâmetro

Método e Interpretação

Comentário

Semi-Quantitativa

Lamino cultivo e Dispstick ou Dip-slide

Técnica semi-quantitativa

Quantitativa

Pour-plate 1 microrganismo = 1000 UFC/ml

Método clássico padronizado raramente utilizado, pois é muito trabalhoso.

Alça calibrada = 0,01 ml

1 colônia = 100 UFC/ml

Alça calibrada = 0,001 ml

1 colônia = 1000 UFC/ml



Mais utilizada e de fácil execução



Lamino-cultivo
O lamino-cultivo consiste de um recipiente plástico cilíndrico, onde pode também ser coletado a urina, com uma tampa ligada a um suporte plástico com duas faces contendo meios de cultura como CLED e Mac Conkey ou outras combinações. Esta técnica tem sido muito utilizada tanto por laboratórios com pequena rotina, como aqueles de grande movimento pelos seguintes motivos:

  • Facilita a semeadura, pois não necessita de alça calibrada ou outra medida de volume.

  • Facilita o transporte da urina semeada utilizando o próprio recipiente do lamino-cultivo.

  • Fácil conservação do produto em temperatura ambiente por cerca de seis meses.

  • Identificação sumária dos principais patógenos encontrados, dependendo do produto adquirido.

Estes meios permitem identificar através de algumas provas bioquímicas rápidas alguns dos principais gêneros de bactérias ou pelo menos sugerir ou afastar a presença de E. coli. A coleta deve seguir os padrões normais de assepsia e orientação, e a semeadura é feita sobre o próprio lamino-cultivo, de forma que as faces do produto sejam colocadas uniformemente em contato com a urina.

    • despejando-se a urina durante a coleta ou após coletada em frasco estéril

    • semeada com um swab embebido na urina homogeneizada.

As principais desvantagens do método são:



  • o método é semi-quantitativo

  • superfície menor de leitura e observação de crescimento


Método Pour plate
Preparar previamente a diluição da urina para obtenção de um fator a ser utilizado na interpretação.


  • 9,9 ml de salina + 0,1 ml da urina (10-2)

  • 9,9 ml de salina + 0,1 ml da 1ª diluição (10-4)

  • Adicionar 1 ml da última diluição em placa de Petri (150 mm)




  • Acrescentar o Ágar Müller Hinton (fundido), homogeneizando e incubando à 35-37ºC em aerobiose durante 24 h.

  • A leitura é feita multiplicando o número de colônias obtido, pelo fator de diluição.


Semeadura com Alça Calibrada
Alguns trabalhos recomendam a semeadura das urinas somente com a alça calibrada 0,01µl (10 µL), procurando detectar-se contagem de colônias a partir de 100 UFC/ml, outros trabalhos porém recomendam a semeadura de acordo com a origem da amostra como o proposto abaixo.
Recomendação da Inoculação por Alça Calibrada segundo a origem da amostra clínica de urina


Amostra

0,001 ml ou 1 µl 1

0,010 ml ou 10 µl 2

Jato médio feminino




X

Jato médio masculino

X




Cateter

X




Punção Supra-púbica




X

Cistoscopia




X

1- uma colônia com alça de 1 µL = 1000 UFC/ml

2- uma colônia com alça de 10 µL = 100 UFC/ml

Utilizado para amostras onde a contagem de colônias baixa tem significado clínico


Esse método consiste em utilizar a urina não diluída, e fazer a semeadura utilizando-se uma alça de platina ou de plástico (disponível comercialmente), de diâmetro calibrado capaz de carrear uma quantidade fixa de urina (0,001 ou 0,01ml), padronizando desse modo o fator de diluição.
Técnica: Em sua execução a alça bacteriológica é introduzida em uma amostra de urina bem homogeneizada, fazendo-se movimentos para baixo e para cima no sentido vertical. A alça carregada é então utilizada para inocular cada meio de cultura, fazendo-se, inicialmente, uma linha reta no centro da placa e completando-se o espalhamento com uma série de passagens em um ângulo de 90º, através da linha original. Importante item de controle de qualidade é utilizar alças calibradas periodicamente aferidas ou, quando possível, alças descartáveis.
Meios de cultura: As placas com meio seletivo (Mac Conkey ou EMB) e outro meio não seletivo (Ágar Sangue de Carneiro a 5%) deverão ser incubadas 24 horas à 35-37ºC, devendo este período ser prolongado quando as condições clínicas justificarem ou quando houver suspeita de infecção por Gram positivos (Enterococos e Streptococcus agalactiae ou leveduras). Atualmente utiliza-se muito o meio CLED, que permite crescimento das enterobacterias, impedindo o espalhamento dos Proteus, a maioria dos gram positivos e leveduras. É prudente a leitura em 48-72 horas quando a contagem de leucócitos ou a bacterioscopia sugerirem infecção urinária e não for verificado crescimento bacteriano em 24 horas.
Nos casos de suspeita clínica de ITU por anaeróbios, o material clínico adequado para cultura é a urina obtida por punção supra-púbica e semeada de acordo com as orientações deste manual para cultura de anaeróbios. Quando houver suspeita de ITU fúngica, recomenda-se semear de acordo com as orientações deste manual referentes às infecções fúngicas.
Outros dados laboratoriais que podem contribuir para o diagnóstico:


  • Hematúria: quando detectada isoladamente sugere tuberculose renal, litíase renal, doença policística renal, cistite viral e trauma após cateterização.

  • Proteinúria: resposta fisiológica à exercícios físicos prolongados ou postura ereta (proteinúria ortotástica)

  • Hemocultura positiva: indica a presença de microrganismo na corrente sangüínea proveniente de um sítio conhecido (pulmão, osso, dente etc.) ou de um sítio desconhecido. Em pacientes com pielonefrite aguda a hemocultura é positiva em 25%. A bacteremia é também bastante freqüente nos neonatos com infecção do trato urinário.

Prostatite - Cerca de 50% dos homens em algum momento da vida irão apresentar sintomas sugestivos de prostatite, embora apenas 5-10% serão caracterizados como casos agudos ou crônicos. Os demais apresentarão quadros inflamatórios não infecciosos. O diagnóstico de prostatite bacteriana aguda é, muitas vezes, confundido nos homens abaixo de 50 anos com infecção urinária. A prostatite pode ser detectada com base em uroculturas positivas, ou cultura de secreção prostática com presença de neutrófilos na secreção. Os sintomas, geralmente, são intensos na infecção aguda, enquanto que na prostatite crônica eles são insidiosos, manifestando-se por infecções urinárias repetidas, ou sintomas genitourinários irritativos ou obstrutivos.
Na fase aguda é contra-indicada a coleta de secreção prostática pela dor, embora o toque retal cuidadoso já possa sugerir este diagnóstico, documentado por urocultura. Os principais agentes são a E. coli, Proteus spp.,e outras enterobacterias, sendo menos freqüente o enterococo. É controvertido o papel de estafilococos, Gardnerella, Haemophilus, Chlamydia, Mycoplasma, Trichomonas e vírus.



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