Iv. Expressão de Opri-nef em



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IV. Expressão de OprI-Nef em E. coli

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IV. Expressão Em Escherichia coli Da Proteína Nef Do Vih-1 Como Um Produto De Fusão Com A Lipoproteína OprI Da Membrana Externa De Pseudomonas aeruginosa



  1. Materiais e métodos





    1. Materiais




      1. Plasmídios e estirpes de Escherichia coli

O plasmídio pVUB3nef8E5, cuja construção foi descrita no capítulo anterior, foi mantido na estirpe JM109 de E. coli (para características genotípicas desta estirpe, ver secção correspondente no capítulo III).





      1. Meios de cultura




        1. Meio líquido

Meio mínimo M9 (Miller, 1972) suplementado (J. Cote-Sierra, comunicação pessoal)



  • Sais M9 X 10 100 ml

  • MgSO4 1 M 1 ml

  • CaCl2 0,1 M 1 ml

  • Glucose a 50% (p/v) 4 ml

  • Casaminoácidos a 20% (p/v) 5 ml

  • Vitamina B1 a 0,5% (p/v) 0,1 ml

  • FeCl3 0,1 M (em HCl 0,1 N) 0,5 ml

  • ZnSO4 1 M 0,4 ml

  • H2O ultrapura q.b. para 1000 ml

A solução de sais M9 X 10 tem a seguinte composição: Na2HPO4 60 g; KH2PO4 30 g; NaCl 5 g; NH4Cl 10 g; H2O ultrapura q.b. para 1000 ml.




        1. Meio sólido

Quando necessário, o crescimento em meio sólido da estirpe E. coli JM109 pVUB3nef8E5 foi efectuado em meio mínimo M9 suplementado, sem iões Fe3+ e Zn2+, ao qual foi adicionado agar fundido estéril a 1,4% (p/v), em substituição da água ultrapura.





      1. Enzimas

Para efectuar a lise bacteriana, de modo a proceder à extracção e purificação das proteínas da membrana externa de E. coli, foi utilizada a lisozima cristalizada da clara de ovo (Boehringer Mannheim, Alemanha).





      1. Anticorpos primários e secundários (conjugados)

De acordo com o objectivo de cada experiência de Western blotting, foram utilizados diferentes anticorpos primários nas diversas fases deste trabalho. Assim, para a detecção de epitopos da lipoproteína OprI na proteína de fusão OprI-Nef foi utilizado o anticorpo monoclonal anti-OprI QB2, gentilmente cedido pelo Dr. Pierre Cornelis (Universidade Livre de Bruxelas, Bélgica). Para a detecção de determinantes antigénicos de Nef na proteína de fusão OprI-Nef foram testados três anticorpos primários diferentes, com origem no AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH, E.U.A.: os anticorpos monoclonais EH1 e 6.2 e um anticorpo policlonal de coelho anti-Nef. Dependendo da origem biológica dos anticorpos primários utilizados previamente, foram utilizados dois anticorpos secundários (conjugados) diferentes: um complexo de IgGs de ovelha anti-IgG (subclasses 1, 2a, 2b e 3) e -IgM de murganho conjugadas com peroxidase de rábano picante (Boehringer Mannheim, Alemanha) e um conjugado de IgGs de cabra anti-IgG (total) de coelho com a mesma enzima (Sigma, E.U.A.).





      1. Tampões e outras soluções

Tampões utilizados na extracção e purificação das proteínas da membrana externa de E. coli:



  • Tampão de lavagem: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0




  • Tampão de lise: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; glucose 50 mM; EDTA 10 mM; lisozima a 2,5 mg/ml; PMSF 1 mM




  • Tampão de solubilização: Tris-HCl 30 mM, pH 8,0; EDTA 5 mM; Triton X-100 a 1% (v/v)

Tampões utilizados na electroforese de proteínas em gel desnaturante de poliacrilamida/SDS sistema descontínuo de Laemmli (1970):



  • Tampão do gel de concentração: Tris-HCl 0,5 M; SDS a 0,4% (p/v); pH 6,8




  • Tampão do gel de separação: Tris-HCl 1,5 M; SDS a 0,4% (p/v); pH 8,8




  • Tampão de aplicação ou de amostra: Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8; SDS a 2% (p/v); glicerol a 10% (v/v); -mercaptoetanol a 2,5% (v/v); azul de bromofenol a 0,01% (p/v)




  • Tampão de electroforese (tampão Tris-glicina-SDS): Tris-HCl 25 mM; glicina 192 mM; SDS a 0,1% (p/v); pH 8,3

Solução de coloração para géis de proteínas:



  • Azul brilhante de Coomassie R-250 (Bio-Rad, E.U.A.) a 0,125% (p/v); metanol a 50% (v/v); ácido acético a 10% (v/v); em H2O ultrapura

Soluções de descoloração para géis de proteínas:



  • Solução I: metanol-ácido acético-H2O, 5:1:5

  • Solução II: metanol-ácido acético-H2O, 2:1:7

Tampão de transferência para Western blotting (tampão de Towbin):



  • Tris-HCl 25 mM; glicina 192 mM; metanol a 20% (v/v)

Tampão TBS:



  • Tris-HCl 0,1 M; NaCl 150 mM; pH 7,5

Tampão TBST:



  • Tampão TBS com Tween 20 a 0,05% (v/v)

Tampão de bloqueio:



  • Leite desnatado em pó (Régilait, França) a 5% (p/v), em tampão TBST

Substratos para conjugados com a peroxidase de rábano picante:



  • Sistema de revelação para Western blots SuperSignal (Pierce, E.U.A.)

  • 4-cloro-1-naftol 0,48 mM; Tris-HCl 50 mM; NaCl 0,2 M; em metanol a 17% (v/v) + H2O2 a 0,01% (v/v) (Sigma, E.U.A.)

  • Sistema de revelação FAST DAB Peroxidase Substrate Tablet Set composição, quando pronto a utilizar, 3, 3’-diaminobenzidina a 0,7 mg/ml; ureia-H2O2 a 0,2 mg/ml; em Tris-HCl 0,06 M (Sigma, E.U.A.)

Tampão PBS:



  • NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO47H2O 5 mM; KH2PO4 1,8 mM; pH 7,4



      1. Marcadores de peso molecular

No decurso deste trabalho foram utilizados os seguintes marcadores de peso molecular para electroforese de proteínas em gel de poliacrilamida/SDS:



  • Padrão colorido Rainbow (Amersham Life Science, Reino Unido) mistura de 7 proteínas de 220, 97,4, 66, 46, 30, 21,5 e 14,3 kDa

  • LMW Electrophoresis Calibration Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Suécia) mistura de 6 proteínas de 94, 67, 43, 30, 20,1 e 14,4 kDa

A selecção do marcador de peso molecular foi realizada de acordo com o objectivo específico de cada experiência. Regra geral, foi utilizado o padrão colorido Rainbow nas electroforeses preparativas (para transferência por Western) e o padrão LMW nas electroforeses analíticas. A quantidade de marcador a aplicar em gel foi determinada de acordo com as especificações de cada fabricante.



    1. Métodos




      1. Preparação de material e soluções

A preparação de todo o material necessário para a realização das experiências constantes neste capítulo seguiu as directrizes gerais já descritas anteriormente (ver secção 1.2.1., do capítulo III).




      1. Condições de crescimento bacteriano

Todas as culturas de rotina, bem como as experiências de viabilidade celular e de indução da expressão da proteína de fusão OprI-Nef, foram realizadas em meio mínimo M9 suplementado com casaminoácidos (meio M9CAA), vitamina B1 (tiamina) e iões Fe3+ e Zn2+, com arejamento apropriado (N=220 rpm), a 37C, durante o tempo adequado a cada experiência. Para isolamento de clones em placa, foi utilizado o meio sólido M9CAA suplementado, sendo as placas incubadas a 37C, durante a noite. O antibiótico ampicilina foi adicionado aos meios de crescimento para uma concentração final de 100 g/ml.





      1. Manutenção de estirpes bacterianas, plasmídios e extractos proteicos

A estirpe bacteriana utilizada neste trabalho, transformada com o plasmídio recombinante pVUB3nef8E5, foi mantida do modo descrito na secção 1.2.3. do capítulo anterior. O plasmídio purificado foi mantido em água ultrapura estéril, a -20C, e os extractos proteicos totais e da membrana externa de E. coli foram guardados em tampão de amostra, também a -20C, depois de desnaturados a 100C, durante 3 minutos.





      1. Experiências de viabilidade celular

Os testes de viabilidade celular, após indução da expressão proteica com IPTG, foram realizados em meio M9CAA suplementado, a 37C, com boas condições de arejamento das culturas (N=220 rpm). Culturas densas da estirpe E. coli JM109 pVUB3nef8E5, crescida durante a noite nas mesmas condições, eram diluídas 1:20 em 100 ml do mesmo meio, pré-aquecido, após o que se reiniciava a incubação. Leituras de absorvância eram realizadas periodicamente, até se atingir uma D.O.6000,7 (aproximadamente, 2,5-3 horas após a diluição inicial). Retirava-se então uma alíquota de 10 l de cultura bacteriana (controlo de pré-indução ou t0), sendo aquela imediatamente dividida em 4 subculturas de igual volume (25 ml). Para a indução da expressão proteica a partir de pVUB3nef8E5, adicionava-se IPTG para três concentrações finais diferentes (1, 0,5 e 0,1 mM) e, como controlo, deixava-se uma subcultura não induzida, a crescer nas mesmas condições experimentais. Em cada uma das 4 subculturas, eram retiradas alíquotas de 10 l, uma, três e cinco horas após a indução (t1, t3 e t5). À medida que iam sendo retiradas, todas as alíquotas eram imediatamente diluídas 1:100 numa solução fria de NaCl a 0,9% (p/v), realizando-se de seguida as diluições seriadas julgadas necessárias, na mesma solução. Plaqueavam-se depois, em triplicado, as diluições apropriadas em meio sólido M9CAA com ampicilina (100 g/ml). As placas inoculadas eram incubadas em estufa a 37C, durante a noite, após o que se procedia à contagem do número de colónias bacterianas por placa. Finalmente, era determinado o número de células viáveis por mililitro de cultura original e procedia-se à representação gráfica da sua variação em função do tempo decorrido após a indução com IPTG.





      1. Indução da expressão de OprI-Nef em E. coli

Culturas de E. coli JM109 pVUB3nef8E5 eram crescidas durante a noite a 37C, com agitação vigorosa, em meio M9CAA suplementado, com ampicilina, e, na manhã seguinte, eram utilizadas para a realização de subculturas, após diluição inicial de 1:20 em 200 ml do mesmo meio, pré-aquecido. As subculturas eram incubadas nas mesmas condições até se atingir uma D.O.600 compreendida entre 0,6 e 0,7. Imediatamente antes de se proceder à indução com IPTG da expressão de OprI-Nef, removia-se uma alíquota de 1 ml de cultura, que servia como controlo não induzido (t0) em cada experiência e que sofria o tratamento descrito na secção seguinte. Para a realização da indução, adicionava-se IPTG à cultura para uma concentração final de 0,1 mM e deixava-se aquela a crescer, nas mesmas condições, durante mais 3 horas, após o que se removia novamente uma alíquota de 1 ml de cultura (esta serviria para a preparação de um extracto proteico total após 3 horas de indução – t3). As bactérias restantes eram então sedimentadas por centrifugação a 5500 g, durante 10 minutos, a 4C. O sobrenadante, constituído pelo meio de crescimento, era rejeitado e as células eram rapidamente congeladas a -20C, caso não se prosseguisse de imediato para a preparação de extractos proteicos da membrana externa (ver secção 1.2.7.).





      1. Preparação de extractos proteicos totais a partir de culturas de E. coli

Lisados celulares totais foram preparados a partir de alíquotas de 1 ml de culturas de E. coli JM109 pVUB3nef8E5 não induzidas (t0) e induzidas (t3), obtidas como descrito na secção anterior. As células presentes nestas alíquotas eram sedimentadas rapidamente por centrifugação (16000 g, 1 minuto) e ressuspendidas, respectivamente, em 50 e 100 l de tampão de amostra. Os extractos proteicos totais assim obtidos eram desnaturados a 100C, num banho de água fervente, durante 3 minutos, ficando então prontos para aplicação em gel de poliacrilamida/SDS. Caso isso não ocorresse de imediato, eram mantidos a -20C até posterior utilização.





      1. Preparação de fracções proteicas da membrana externa a partir de culturas de E. coli

Fracções proteicas da membrana externa foram preparadas a partir de 200 ml de culturas de E. coli JM109 pVUB3nef8E5 não induzidas e induzidas sob diversas condições, utilizando o método descrito por Cornelis et al. (1989), baseado na solubilização da membrana interna com N-lauril-sarcosinato de sódio (Sarkosyl) (Filip et al., 1973), com modificações (J. Cote-Sierra, comunicação pessoal). As bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 5500 g, durante 10 minutos, a 4C, e o sedimento celular obtido foi lavado uma vez com 4 ml de tampão de lavagem. Após a lavagem, as células foram ressuspendidas em 4 ml de tampão de lise (a lisozima e o PMSF foram adicionados no momento). O lisado celular foi colocado em gelo, misturando-se continuamente a suspensão até se conseguir uma completa homogeneização. Adicionou-se 4 ml de Sarkosyl a 2% (p/v), misturou-se suavemente, de modo a obter-se uma completa clarificação, e transferiu-se a suspensão para um tubo Falcon de 15 ml. De modo a reduzir a sua elevada viscosidade, devida à presença de ADN intacto libertado das células, a suspensão foi então submetida à emissão pulsada de ultra-sons (Ultrasonic Homogenizer 4710, Cole Parmer, E.U.A., com duty cycle 50% e output control 4). A suspensão, colocada no gelo, foi submetida a ciclos de sonicação de 30 segundos de duração, alternados com intervalos da mesma duração, até se atingir uma viscosidade semelhante à da água. A seguir, as proteínas da membrana externa foram sedimentadas por ultracentrifugação a 210000 g, durante 2 horas, a 4C, tendo-se recolhido o sobrenadante, que continha a fracção proteica citoplasmática, periplasmática e da membrana interna. O sedimento translúcido, correspondente à fracção proteica da membrana externa, foi lavado suavemente, duas vezes, com 5 ml de Sarkosyl a 2% (p/v) e o sedimento final foi ressuspendido em 1 ml de tampão de solubilização. Esta solução foi dividida em alíquotas e armazenada a -20C, até utilização. Antes da sua aplicação em gel de poliacrilamida/SDS, 50 l da solução contendo a fracção proteica da membrana externa foram misturados com 50 l de tampão de amostra, seguindo-se aquecimento a 100C, num banho de água fervente, durante 3 minutos.





      1. Concentração de proteínas com acetona

De modo a realizar a concentração das proteínas presentes numa solução diluída, neste caso, nos sobrenadantes das culturas bacterianas, procedeu-se à sua precipitação por acção da acetona. Adicionaram-se à solução proteica 9 volumes de acetona pré-arrefecida a -20C, misturou-se por inversão e deixou-se a precipitar à temperatura referida, durante a noite. Iniciou-se a recuperação das proteínas precipitadas, por centrifugação a 12000 g, a 4C, durante 5 minutos. Removeu-se a acetona e deixou-se secar bem ao ar o sedimento proteico durante alguns minutos. Este foi dissolvido num volume apropriado de tampão de amostra, seguindo-se a desnaturação proteica, como descrito anteriormente.





      1. Electroforese de proteínas em gel de poliacrilamida/SDS


No decurso deste trabalho foram realizadas várias separações de misturas de proteínas por electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida com SDS, utilizando o sistema descontínuo de Laemmli (1970), com ligeiras modificações. Ao longo do trabalho, foram basicamente utilizados dois tipos de géis de separação: de concentração uniforme de poliacrilamida 12% (p/v) e 15% (p/v) e de gradiente contínuo 7,5-22,5% (p/v). Em todos os casos, o gel de concentração utilizado era a 3,9% (p/v) e todos os géis tinham 0,75 mm de espessura. Para fazer 20 ml de um gel de separação a 12% (p/v), mediam-se 8 ml de uma solução comercial de acrilamida a 30% (p/v)/N, N’-metileno bisacrilamida a 0,8% (p/v) (Bio-Rad, E.U.A.) para um copo de vidro, aos quais eram adicionados 5 ml do tampão respectivo e 7 ml de H2O ultrapura. Depois da montagem do sistema de molde para a formação do gel, com os respectivos vidros e espaçadores (sistema The Sturdier, Hoefer SE400, Amersham Pharmacia Biotech, Suécia), adicionavam-se 65 l de persulfato de amónio a 10% (p/v) e 15 l de N, N, N’, N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED), de modo a iniciar a polimerização. O gel era então vertido rapidamente para o interior do sistema de molde, evitando a formação de bolhas, e era depois coberto com 1-2 ml de etanol absoluto, deixando-se a polimerizar, à temperatura ambiente, durante cerca de 30 a 45 minutos. Depois de polimerizado, removia-se o etanol, lavava-se uma vez com H2O ultrapura e cobria-se o gel de separação até ao cimo com a mistura do gel de concentração, no qual, pela introdução de um pente adequado, seriam formados os poços para aplicação das amostras proteicas. O gel de concentração era feito pela mistura sucessiva de 0,65 ml de solução comercial de acrilamida a 30% (p/v)/N, N’-metileno bisacrilamida a 0,8% (p/v) (Bio-Rad, E.U.A.), 1,25 ml do tampão respectivo, 3,05 ml de H2O ultrapura, 27 l de persulfato de amónio a 10% (p/v) e 5 l de TEMED. Aguardavam-se entre 15 a 30 minutos, à temperatura ambiente, de modo a que ocorresse a sua polimerização, após o que se removia o pente e cobria o gel de concentração com tampão de electroforese (tampão Tris-glicina-SDS), prosseguindo-se finalmente para a aplicação das amostras. Paralelamente, era sempre aplicada em cada gel uma mistura de proteínas de peso molecular conhecido que serviam como marcadores. O protocolo apresentado para os géis de separação era, obviamente, adaptado, sempre que se utilizavam géis de outras concentrações, nomeadamente a 15% (p/v). Para os géis de gradiente contínuo de concentração, era necessário fazer-se duas soluções de gel de poliacrilamida/SDS uma a 7,5% (p/v) e outra a 22,5% (p/v), sendo que a formação do gradiente entre ambas era conseguida pela utilização de um formador de gradientes MSE e de uma bomba peristáltica (Minipuls 3, Gilson, França). A electroforese decorria em tampão Tris-glicina-SDS, sob uma diferença de potencial e por tempo dependentes das características de cada gel (testes prévios foram realizados até se optimizarem as condições de separação electroforética).



      1. Detecção não específica de proteínas por coloração com azul brilhante de Coomassie

Após a separação das proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida/SDS, os géis eram cuidadosamente submergidos em solução de coloração, onde permaneciam durante 1 hora, a 37C, com agitação suave. Depois de decantar a solução de coloração, e de modo a remover o excesso de corante, os géis eram descorados com a solução I de descoloração, durante 1 hora, à temperatura ambiente, também com agitação. Após esta primeira fase de descoloração, submergiam-se os géis na solução II de descoloração, durante 30 minutos a 1 hora, nas mesmas condições experimentais. Antes de se iniciar a sua secagem, retirava-se o excesso de solução de descoloração, por passagem rápida dos géis em água ultrapura. A secagem era realizada sob vácuo, com recurso a um secador de géis (sistema Drygel Sr., Hoefer SE1160, Amersham Pharmacia Biotech, Suécia), durante 1 hora, a 60C, após colocação do gel entre película aderente e uma folha de papel 3 MM Chr embebida previamente em água ultrapura.





      1. Transferência de proteínas para suporte sólido e sua detecção específica por métodos imunoenzimáticos (Western blotting)

Alíquotas de extractos proteicos totais e da membrana externa de diversas culturas bacterianas, previamente preparados com tampão de amostra, eram aplicadas em géis de poliacrilamida/SDS, sendo as proteínas separadas de acordo com as especificações referidas anteriormente. Após a separação, as proteínas eram transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Suécia), em tampão de Towbin, num aparelho de transferência Hoefer Transphor TE62X (Amersham Pharmacia Biotech, Suécia), de acordo com protocolos convencionais (Towbin et al., 1979; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1997). A transferência decorria a uma intensidade de corrente fixa de 600 mA (V55 V), durante 1,5 horas, com circulação de água. Após a transferência, as membranas eram lavadas em tampão TBST durante 30 minutos, com agitação suave, e bloqueadas em tampão de bloqueio (no mínimo, 0,1 ml de tampão para cada cm2 de membrana), durante 1 hora, também com agitação, sempre à temperatura ambiente, tal como todo o protocolo. Seguia-se uma incubação, com agitação, durante 1 hora, com o primeiro anticorpo diluído em tampão de bloqueio, no volume indicado anteriormente, após o que se seguia um período de lavagem, de modo a remover todo o anticorpo primário não ligado ou ligado de um modo não específico à membrana. A lavagem era realizada com TBST, durante 3 períodos consecutivos de 10 minutos cada, trocando-se sempre o tampão e cobrindo bem a membrana. Prosseguia-se então para a incubação com o anticorpo secundário (conjugado) diluído no tampão de bloqueio, durante 1 hora, com agitação suave. Após a segunda incubação, procedia-se à lavagem da membrana como descrito anteriormente, isto é, 3 X 10 minutos, com TBST, seguindo-se finalmente a fase de revelação dos imunocomplexos. Foram realizados testes prévios a vários sistemas de coloração, tendo sido seleccionado para a realização deste trabalho o sistema FAST DAB Peroxidase Substrate Tablet Set (Sigma, E.U.A.), que era utilizado de acordo com as especificações do fabricante.





      1. Coloração de proteínas imobilizadas em membrana de nitrocelulose

Como controlo da correcta transferência por Western blotting, procedia-se, por vezes, à detecção não específica das proteínas imobilizadas em membranas de nitrocelulose através da sua coloração com tinta-da-China. Primeiramente, procedia-se duas vezes à lavagem dos blots em tampão PBS com Tween 20 a 0,4% (v/v), com agitação suave, durante 5 minutos, à temperatura ambiente. Depois, deixavam-se os blots numa solução de tampão PBS com Tween 20 a 0,3% (v/v) e tinta-da-China (Pelikan) a 0,1% (v/v), sem agitação, durante 1 hora, também à temperatura ambiente. Lavavam-se repetidamente os blots em água ultrapura até descorar completamente o fundo da membrana e deixavam-se a secar ao ar, entre folhas de papel absorvente. Este método permitia ainda a identificação mais precisa das proteínas reconhecidas pelos anticorpos utilizados nas experiências de imunodetecção.







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