Espectrofotometria visível e ultravioleta



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ESPECTROSCOPIA VISÍVEL E ULTRAVIOLETA

Princípios básicos
A espectrofotometria visível e ultravioleta é um dos métodos analíticos mais usados nas determinações analíticas em diversas áreas. É aplicada para determinações de compostos orgânicos e inorgânicos, como, por exemplo, na identificação do princípio ativo de fármacos.

A espectroscopia de absorção molecular é valiosa para a identificação dos grupos funcionais na molécula. Mais importante, entretanto, são as aplicações da espectroscopia de absorção visível/ ultravioleta para a determinação quantitativa de compostos contendo grupos absorventes.

A região ultravioleta do espectro é geralmente considerada na faixa de 200 a 400 nm, e a região do visível entre 400 a 800 nm. As energias correspondentes a essas regiões são ao redor de 150 a 72 k.cal.mol-1 na região ultravioleta, e 72 a 36 k.cal.mol-1 para a região visível. Energias dessa magnitude correspondem, muitas vezes, à diferença entre estados eletrônicos de muitas moléculas.

A absorção da região visível e ultravioleta depende, em primeiro lugar, do número e do arranjo dos elétrons nas moléculas ou íons absorventes. Como conseqüência, o pico de absorção pode ser correlacionado com o tipo de ligação que existe na espécie que está sendo estudada.

De um ponto de vista prático, o aspecto mais importante do cálculo quântico é a determinação de quanta luz é absorvida pela amostra. Isto é descrito pela lei de Beer- Lambert, que dá a relação entre a intensidade da luz incidindo na solução (I0), e a intensidade da luz saindo da solução (I).
Log (I0/ I) =A=cl

A= absorbância

= absorvidade molecular ou coeficiente de extinção



c= concentração do material absorvedor

l= espessura da amostra da amostra através da qual a luz passa.
A absorção pelos compostos orgânicos e inorgânicos é relacionada com uma deficiência de elétrons na molécula. Nos inorgânicos, o comprimento de onda de absorção das transições “d-d” depende do metal envolvido, do número de grupos coordenados, da basicidade, dos átomos doadores e da geometria dos grupos coordenados.

Nos compostos orgânicos, os que possuem dupla ligação absorvem fortemente no ultravioleta remoto. Os compostos que possuem ligações simples e duplas alternadamente, chamadas de ligações conjugadas, produzem absorção em comprimentos de ondas maiores. Quanto mais extenso for o sistema conjugado, mais longos serão os comprimentos de onda absorvidos, podendo chegar à região do visível.


Desvios da Lei de Lambert-Beer
Desvios químicos

Deslocamento do equilíbrio: quando um analito dissocia, associa ou reage com um solvente para formar um produto que tem um espectro de absorção diferente do analito. Ex: indicador ácido-base.
Dissociação de complexos: excesso ou insuficiência de agente complexante.
Desvios instrumentais

Em soluções muito concentradas, as moléculas de soluto influenciam umas às outras devido a suas proximidades, pois quando ficam muito perto umas das outras, a absorvidade pode mudar um pouco.



Espectrofotômetros
Espectrofotômetros são instrumentos capazes de registrar dados de absorvância ou transmitância em função do comprimento de onda. Este registro é chamado de espectro de absorção ou de espectro de transmissão, segundo o dado registrado for de absorvância ou transmitância, respectivamente. O espectro de absorção é característico para cada espécie química, sendo possível a identificação de uma espécie química por seu “espectro de absorção”.

A característica mais importante dos espectrofotômetros é a seleção de radiações monocromáticas, o que possibilita inúmeras determinações quantitativas regidas pela Lei de Beer. Quando a região espectral usada é a ultravioleta/visível, são necessários componentes óticos de quartzo e detectores altamente sensíveis capazes de detectar radiações nessa extensa faixa espectral em que atua o instrumento. Os espectrofotômetros, em geral, contêm cinco componentes principais: fontes de radiação, monocromador, recipientes para conter as soluções, detectores e indicadores de sinal.




Esquema dos componentes principais de um espectrofotômetro


Fontes de radiação
As fontes de radiação mais comuns baseiam-se na incandescência e são muito práticas no infravermelho e no visível, mas devem atuar em temperaturas elevadas na faixa do ultravioleta. As fontes de radiação são constituídas por filamentos de materiais que são excitados por descargas elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico.

Para que uma fonte de radiação seja considerada de boa qualidade deve:

- gerar radiação continua, ou seja, emitir todos os comprimentos de onda, dentro da região espectral utilizada;

- ter intensidade de potência radiante suficiente para permitir a sua detecção pelo sistema detector da máquina;

-ser estável, isto é, a potência radiante deve ser constante. Além disso, deve ter vida longa e preço baixo.
Tipos de fontes de radiação
Lâmpada de filamento de tungstênio: incandescente, produz emissão continua na faixa e 320 a 2500nm. O invólucro de vidro absorve toda radiação abaixo de 320nm, limitando o uso da lâmpada para o visível e infravermelho.

Lâmpada de quartzo-iodo: incandescente, o invólucro de quartzo emite radiação de 200 a 3000nm. Sua vantagem é que pode atuar na região do ultravioleta.

Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério: é a mais usada para emissão de radiação ultravioleta. Consiste em um par de eletrodos fechados em um tubo de quartzo ou vidro, com janela de quartzo, preenchido com gás hidrogênio ou deutério. Aplicando alta voltagem, produz-se uma descarga de elétrons que excitam outros elétrons gasosos a altos níveis energéticos. Quando os elétrons voltam a seus estados fundamentais, emitem radiação contínua de 180 a 370nm.

Lâmpada de catodo oco: tipo especial de fonte de linha. É preenchida com um gás nobre, a fim de manter uma descarga de arco. O cátodo tem a forma de um cilindro oco, fechado em uma extremidade, revestido com o metal cujas linhas espectrais se desejam obter. O ânodo é um fio reto ao lado do cátodo. A energia do arco causa ejeção dos átomos metálicos do revestimento do cátodo os quais, excitados, emitem os seus espectros característicos.

Laser: pelo processo de emissão estimulada, os lasers produzem uma enxurrada de feixes muito estreitos e intensos de radiação. Todas as ondas procedentes ao material emissor estão em fase entre si, e, por isso, praticamente não apresenta dispersão quando se propaga.

Isso permite uma concentração de energia num ponto muito pequeno, mesmo que esteja numa distância considerável.


Monocromadores

São dispositivos essenciais dos espectrofotômetros e tem como função a seleção do comprimento de onda e que se tem interesse para a análise. È constituído de uma fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação e de uma fenda de saída. O elemento de dispersão pode ser um prisma ou uma rede de difração.



1) Monocromador prismático: a radiação policromática procedente da fonte de radiação passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo desvio. Os prismas de quartzo são indicados para trabalhar na região ultravioleta, embora tenham mais dispersão que o vidro. Na região do visível são empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo apresentam desvantagem de serem altamente refringentes e oticamente ativos.
2) Monocromador reticular: o principal elemento de dispersão dos monocromadores reticulares é a rede de difração, que consiste em uma placa transparente com inúmeras ranhuras paralelas e de mesma distância. As redes de difração dispersam a radiação policromática baseadas no fenômeno da interferência, e a dispersão resultante desta rede é linear. As redes de difração possuem resolução melhor que os prismas e podem ser utilizadas em todas as regiões espectrais.
Recipientes
São usados como recipientes cubas ou cubetas retangulares de vidro ou quartzo.

As cubetas de vidro são usadas quando se trabalha na região do visível. Para a região do ultravioleta, devem-se usar as cubetas de quartzo, que são transparentes à radiação ultravioleta, pois o vidro absorve a mesma.

Uma cubeta ideal deve ser de 1 cm, para simplificar os cálculos da expressão da Lei de Beer. As cubetas também podem ter dimensões diferentes, e esse dado deve ser considerado na hora do cálculo.

Para aplicações industriais, como, por exemplo, no controle de qualidade de lotes de produção, utiliza-se um sistema automatizado em que as amostras circulam em série em cubetas adequadas. Esse sistema é chamado de análise por injeção de fluxo ou FIA (do inglês Flow Injection Analysis)


Tipos de espectrofotômetros para região visível e ultravioleta
Os espectrofotômetros variam em sua complexidade e desempenho. Existem modelos simples e mais sofisticados, equipados com softwares especiais de acordo com a necessidade industrial.

Os componentes dos espectrofotômetros estão relacionados com a faixa do comprimento de onda, a exatidão e a precisão requeridos para as análises. Podem ser de dois tipos:

- espectrofotômetros mono-feixe;

- espectrofotômetros duplo-feixe.




  1. Espectrofotômetros mono-feixe: ajusta-se a transmitância em 0%, fechando o obturador entre a fonte de radiação e o detector. Após ocorre o ajuste de transmitância em 100%. Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico, abre-se o obturador e varia-se a intensidade da radiação até que o sinal seja de 100% de transmitância. Então substitui- se o recipiente com solvente pelo recipiente com a amostra e o percentual de transmitância da mesma é lido no indicador de sinal.




  1. Espectrofotômetros de duplo-feixe: dois feixes de radiação são formados no espaço. Um feixe passa pela solução de referência (branco) até o transdutor e o segundo feixe, ao mesmo tempo, passa através da amostra até o segundo transdutor. Nos espectrofotômetros deste tipo o ajuste do 0% é feito com a interrupção de radiação nos dois feixes e o 100% de transmitância é ajustado com o solvente (branco) colocado no caminho ótico dos dois feixes.


Procedimentos analíticos em espectrofotometria visível e ultravioleta
Análise qualitativa: pela analise da absorvância é possível determinar qual espécie química esta presente na amostra. Também é possível detectar contaminações ou processos de decomposição de matérias-primas pela comparação dos espectros de absorção da matéria e do padrão da mesma.
Análise quantitativa: a condição essencial para qualquer determinação por espectrofotometria no visível e ultravioleta é a observação da lei de Beer.

Outras condições como pH, técnicas de extração por solventes, ajuste do estado de oxidação, remoção prévia dos interferentes, controle da força iônica do meio, e as variações das temperaturas também são observadas.



Espectro de proteínas

- possuem espectro bem característico;

-são influenciadas pelo meio local: dependem de fenômenos elétricos;

-mostra a quantidade de hélice α e folha β;

-caso a proteína seja desnaturada, a espectroscopia será diferente.
Espectro de ácidos nucléicos

-tem a absorbância menor que a soma das absorbâncias dos nucleotídeos individuais (hipocromicidade) e ocorre devido ao empilhamento ou alinhamento dos planos paralelos das bases;

-se ocorrer um acréscimo na absorção → hipercromicidade

-serve para determinar se estão estruturados.


Fluorescência e fosforescência

Fluorescência é a emissão de luz associada com elétrons que se movem de um estado excitado para o estado fundamental.

Fosforescência é a capacidade que uma espécie química tem de emitir luz.

As duas são freqüentemente usadas para se estudar processos biológicos e são muito mais úteis que a absorbância, por serem consideravelmente mais sensíveis, podendo, então, detectar concentrações bastante baixas.


Automação nos métodos espectrofotométricos
Os principais motivos para o desenvolvimento de um sistema que viabilizasse várias determinações simultâneas com o mínimo de trabalho humano foram:

- preencher as necessidades dos laboratórios de analises clínicas, devido crescente número de analises;

- o aumento do número de espécies químicas a serem determinadas no sangue e na urina como análise de rotina.

O uso desses instrumentos em laboratórios de análises clínicas foi logo estendido a laboratórios de controle de qualidade de processos industriais num variado tipo de amostras como ar, água solo, produtos agrícolas e farmacêuticos.

As vantagens dos métodos automatizados são:

- maior velocidade no processamento das análises;

- maior confiabilidade nos resultados;

- minimização de contaminações;

- diminuição na geração de resíduos;

- menor consumo de amostras e reagentes.



BIBLIOGRAFIA
Silverstein, R. M., Bassler, G. C., Morrill, T. C., Identificação espectrométrica de compostos orgânicos 5ª ed., LTC.

Vinadé, Maria Elisabeth do Canto; Vinadé, Elsa Regina do Canto, Métodos espectroscópicos de analise quantitativa, editora UFSM.



UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
ESPECTROSCOPIA VISÍVEL E ULTRAVIOLETA
Alice Machado Lemos

Aline Paiva Noble

Hecson Jesser Segat

Isabel Daronco Alexandre

Lauren Pappis

Letícia Teixeira Nunes

Louise Vignoles Neves


Santa Maria, RS, Brasil

2009



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