Efeitos em sistemas de receptores e transportadores para l-glutamato e gaba



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UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA-DQI
PROJETO DE IC -

PIBIC
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO DA PEÇONHA DE Lachesis muta SOBRE LINFÓCITOS HUMANOS.


Aluno: Marcus Vinicius Cardoso Trento

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Marcussi

Lavras - MG

2011
Resumo

Componentes presentes em venenos e peçonhas animais apresentam grande potencial biotecnológico podendo agir sobre o sistema de coagulação, plaquetas, sistema imunológico, apoptose celular, mutagênese, neurotoxicidade, citotoxicidade, além de induzir efeitos bactericida, antiparasitário, antifúngico e antiviral. Alguns medicamentos atualmente comercializados em larga escala em todo o mundo foram produzidos com base em moléculas isoladas de peçonhas como, por exemplo, o Captopril (anti-hipertensivo) e o Ancrod (anti-coagulante). O presente trabalho propõe a realização de experimentos que demonstrem os efeitos da peçonha de Lachesis muta, em ensaios de genotoxicidade em células humanas, in vitro. O potencial genotóxico desta peçonha será avaliado através do teste do cometa, utilizado para avaliação de lesões genômicas passíveis de correção pelos sistemas de reparo celular. Desta forma, este teste pode ser também utilizado para estudos de reparo do DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão reparada, embora não possibilite inferir a fidedignidade do processo de reparo. A análise genotóxica de peçonhas é de suma importância para a identificação e caracterização de potenciais agentes terapêuticos. Destaca-se ainda o fato de se tratar de um campo muito pouco explorado visto pela escassez de trabalhos na literatura sobre genotoxicidade de venenos e peçonhas. Adicionalmente a avaliação de danos citogenéticos induzidos por peçonhas poderá complementar a caracterização de moléculas anteriormente isoladas com alto potencial de aplicação como modelos para novos fármacos, na elaboração de kits diagnósticos ou ainda como ferramentas em estudos laboratoriais.


Palavras-chaves: peçonha de Lachesis muta, cometa, genotoxicidade.
1- Introdução e Referencial Teórico


    1. Peçonhas de serpentes e Aplicações

De acordo com Barravieira (1991) mais de trezentas espécies de serpentes peçonhentas já foram catalogadas no mundo, sendo estas classificadas em cinco famílias principais: Boidae, Colubridae, Viperidae, Elapidae, e Hidhophidae. No Brasil, podem ser encontradas duas famílias de serpentes peçonhentas, Elapidae e Viperidae, representadas por quatro gêneros e seus respectivos nomes populares: Bothrops (jararaca, jararacuçu, urutu, caiçaca), Crotalus (cascavel), Lachesis (surucucu) e Micrurus (coral-verdadeira).

Dentre os casos notificados em que pôde ser definido o gênero da serpente, 90,5% corresponderam a acidentes com Bothrops, 7,7% com Crotalus, 1,4% com Lachesis e 0,4% para Micrurus, sendo observada uma maior taxa de letalidade para os envenenamentos crotálicos (1,87%) (Ministério da saúde, 2001).

As peçonhas de serpentes chamam atenção quanto às inúmeras propriedades bioquímicas, funcionais e estruturais. Sob o ponto de vista biológico, são constituídas, na sua grande maioria, por proteínas e peptídeos, que atuam por diferentes mecanismos na paralisia, morte e digestão da presa (MEBS, 2001). Estas peçonhas apresentam entre 90 e 95% de seu peso seco constituído de proteínas, compreendendo grande variedade de enzimas e toxinas não enzimáticas. Os efeitos são representados principalmente por: miotoxicidade, hemorragia, coagulação sanguínea, neurotoxicidade, citotoxicidade, edema, entre outros. As enzimas proteolíticas presentes nas peçonhas de serpentes podem atuar numa grande variedade de substratos naturais, tais como: caseína, hemoglobina, colágeno, fibrina, elastina, fibrinogênio, insulina, glucagon e outros (IWANAGA e SUZUKI, 1979).

A utilização de proteínas isoladas de venenos e peçonhas animais, assim como proteínas recombinantes, ou peptídeos sintéticos estão se tornando cada vez mais freqüentes entre os grupos de pesquisas e as indústrias de biotecnologia. Os compostos biologicamente ativos da peçonha de serpentes, cujos efeitos tóxicos são relevantes no âmbito de saúde pública, têm amplamente sido utilizados no estudo de estruturas moleculares de receptores neuromusculares e contribuído na compreensão do sistema imunológico (STOCKER, 1990).

A ampla aplicabilidade médica atribuída diretamente ou indiretamente ao uso de toxinas isoladas de peçonhas enfatiza a necessidade de se realizar avaliações quanto aos efeitos das peçonhas e suas toxinas sobre o DNA, uma vez que estas análises podem contribuir para o entendimento dos mecanismos de ação destas moléculas assim como prevenir possíveis efeitos associados ao uso crônico ou em altas doses por seres humanos. Recentemente, uma fosfolipase A2 isolada da peçonha de Lachesis muta nomeada LM-PLA2-I com atividade hemolítica, inibidora de agregação plaquetária, edema e miotoxicidade, mostrou-se também ativa em promover a sobrevivência de células ganglionares da retina podendo ser útil no controle da sobrevivência de células neuronais axotomizadas (da SILVA CUNHA; FULY; de ARAÚJO, 2011).

Atualmente, proteínas de peçonhas têm sido ferramentas para investigar os mecanismos de coagulação do sangue, além de seu uso como modelos moleculares para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento do envenenamento e de algumas patologias (TRENTO et al., 2001).
1.2. Mutagênese

A Toxicologia Genética é uma área da Toxicologia que aborda principalmente os estudos de mutagenicidade, carcinogenicidade e teratogenicidade. Nesta área existem vários ensaios para biomonitoramento da mutagênese e genotoxicidade como, por exemplo, os testes do Micronúcleo e do Cometa (eletroforese em célula única). O método do micronúcleo é simples, e pode ser utilizado para a avaliação de vários tipos de danos citogenéticos, com aplicação na área de ecotoxicologia (Gauthier et al., 1999), nutrição (Fenech e Rinaldi, 1995; Fenech e Ferguson, 2001), avaliação de risco para o câncer, biomonitoramento de populações humanas (Fenech et al., 1999), epidemiologia molecular (Norppa, 1997; Falck et al., 1999) e como teste para a identificação do potencial genotóxico de novos produtos farmacêuticos, agroquímicos ou agentes físicos e químicos em geral (Kirsch-Volders, 1997). Enquanto que o teste do Cometa vem sendo utilizado para detectar lesões genômicas que, após serem processadas, podem resultar em mutação ou são passíveis de correção. Desta forma, este teste pode ser também utilizado para estudos de reparo do DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão reparada, embora não possibilite inferir a fidedignidade do processo de reparo.

De acordo com Ferguson (1994), o uso de agentes antimutagênicos e anticarcinogênicos diariamente será um procedimento mais efetivo na prevenção do câncer e doenças genética humanas. Alguns compostos naturais têm sido recentemente descritos como inibidores de efeitos mutagênicos em bactérias (Kada et al., 1986; Abdelali et al., 1995; Edenharder et al., 1995; Yoshikawa et al., 1996; Uenobe et al., 1997; Edenhader et al., 1997). O própolis, por exemplo, é um composto natural produzido por abelhas africanizadas (Apis mellifera) a partir de gomas de várias plantas, e que tem sido recentemente descrito como agente antimutagênico ou até mesmo mutagênico (FU et al., 2004; TAVARES et al., 2006; RIBEIRO et al., 2006). Peçonhas de abelhas também têm se mostrado, ativos em inibir ou induzir a mutagênese em linhagens de bactérias (VARANDA et al., 1999; WANG et al., 2000). O própolis de Amaicha del Valle, Tucuman e Argentina, por exemplo, foi capaz de inibir a mutagênese da isoquinoline (IQ) e 4-nitro o-phenylenediamine (NPD) (NIEVA MORENO et al., 2005). O efeito antimutagênico do extrato etanólico de própolis (EEP) (Apis mellifera), mostrou-se inibitório sobre a mutagenicidade induzida por daunomycin (TA102), benzo(a)pyrene (TA100) e aflatoxin B1(TA98) de ação direta e indireta em teste de Salmonella/microsomo, e o peçonha de mesma abelha atuou contra a mutagenicidade de 4-nitro-o-phenylenediamine (TA98) e daunomycin (TA102) (VARANDA et al., 1999). Gupta et al. (2007), observaram os efeitos antiproliferativo, citotóxico e pró-apoptótico induzidos pela peçonha de Heterometrus bengalensis Koch, sobre uma linhagem de células humanas leucêmicas, utilizando testes de viabilidade celular e Cometa.

Desta forma a análise genotóxica de peçonhas, assim como a de Lachesis muta, ainda pouco explorada, e suas moléculas isoladas é de suma importância para a identificação e caracterização de potenciais agentes terapêuticos. Destaca-se ainda o fato de se tratar de um campo muito pouco explorado visto pela escassez de trabalhos na literatura sobre genotoxicidade de peçonhas.


2. Objetivo
O objetivo geral deste trabalho é avaliar o potencial genotóxico da peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta, sobre células humanas. Para alcançar o objetivo proposto será utilizado o teste do cometa avaliando o efeito das peçonhas sobre linfócitos humanos cultivados em sangue total.
Justificativas
A avaliação de indução de lesões genômicas (passíveis de correção) que, após serem processadas, podem resultar em mutação, é de suma valia no entendimento das patogêneses, principalmente quando da utilização de agentes biológicos como as proteínas de venenos ou peçonhas. Adicionalmente, será possível a realização de estudos de reparo do DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão reparada.

Embora inúmeras proteínas de venenos e peçonhas de animais tenham sido isoladas e caracterizadas em diversos aspectos, como por exemplo, enzimático, farmacológico, tóxico e estrutural, ainda é muito pequeno o conhecimento a respeito do potencial biotecnológico destas, e a cada pesquisa desenvolvida descobre-se novas possibilidades de utilização destas proteínas podendo resultar na elaboração de futuros medicamentos que induzam menos efeitos colaterais e alternativas promissoras para o tratamento de várias doenças, como o câncer, doenças degenerativas e até a AIDS.

Estudos genotoxicidade têm sido realizados com diferentes toxinas advindas de fungos, mas em relação as peçonhas de serpentes e artrópodes, esta área é praticamente inexplorada, uma vez que existem pouquíssimas publicações envolvendo peçonhas de abelhas (GAJSKI e GARAJ-VRHOVAC, 2008; GARAJ-VRHOVAC e GAJSKI, 2009). A genotoxicidade induzida ou inibida por peçonhas de serpentes é ainda menos explorada, sendo um largo campo para estudos e novas descobertas.

Além disso, estes efeitos poderão ser correlacionados com outras atividades farmacológicas e tóxicas induzidas por estas proteínas buscando elucidar seu(s) possível(eis) mecanismos de ação.


3. Material e Metodologia
3.1. Peçonhas animais:

A peçonha será gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Andreimar Martins Soares da FCFRP-USP que as obtém comercialmente do serpentário Bioagents (Batatais-SP) e do serpentário da Universidade de São Paulo, USP de Ribeirão Preto.


3.2. Teste de genotoxicidade
3.2.1. Teste do cometa para a detecção de dano no DNA e reparo em células individualizadas.

3.2.1.1. Obtenção de amostras celulares e realização do teste do cometa

Para o teste do cometa será utilizada a metodologia de Singh et al. (1988), conforme descrita a seguir. Antes do ensaio do Cometa será realizado o teste de viabilidade celular de exclusão por azul de Trypan, a fim de assegurar que as culturas analisadas tenham células viáveis e em quantidades suficientes (70% ou mais) para não interferir no resultado da análise dos Cometas.

Os testes serão realizados a partir de sangue total com posterior análise apenas dos linfócitos isolados durante o tratamento das lâminas. Os voluntários para doação de alíquotas de sangue deverão apresentar-se saudáveis, com faixa etária de 18 a 35 anos, e não terem feito uso de qualquer medicamento por um período de 30 dias antes da coleta do sangue. Seis voluntários serão necessários sendo o sexo indiferente. Testes piloto serão realizados com a finalidade de definir o tempo adequado de cultivo e tratamento das células uma vez que as amostras testadas poderão estar atuando sobre alguma fase específica do ciclo celular dos linfócitos. O tratamento será então realizado 3 horas após a coleta do sangue e as células permanecerão na presença dos tratamentos por 4h, sendo em seguida utilizadas para o preparo das lâminas, antes que o sistema de reparo celular possa atuar.

Será necessária uma suspensão celular com 106 células/mL, para trabalhar com 5 a 10 mil células por lâmina, embora sejam avaliadas de 50 a 100 células por tratamento.

A solução de lise será preparada e mantida a 4°C. A agarose de baixo ponto de fusão (LMP) será derretida em microondas e transferida para banho-maria a 37°C. As luzes do laboratório permanecerão apagadas durante os próximos passos, em que aproximadamente 10000 células (5 - 15 µL) da amostra celular serão transferidas para um microtubo (padronizar a quantidade para o tipo celular utilizado) contendo 75 – 120 µL de agarose LMP. A mistura será homogeneizada e colocada sobre a lâmina com agarose NMP, sendo coberta com a lamínula. As lâminas permanecerão na geladeira por 5 minutos, a lamínula será então retirada e a lâmina mergulhada na solução de lise recém-preparada.

3.2.1.2. Eletroforese

A solução tampão de eletroforese será preparada e conservada a 4°C, a cuba de eletroforese será colocada em recipiente com gelo, e as lâminas serão retiradas da solução de lise e lavadas por 5 minutos com PBS gelado e em seguida colocadas na cuba de eletroforese. A solução tampão de eletroforese será acrescentada até que cubra as lâminas (4°C), que permanecerão em descanso de 10 – 60 minutos, de acordo com o tipo celular. A fonte de eletroforese será programada com voltagem entre 0,4 e 1,0 V/cm, e miliamperagem 300 mA, o tempo ficará entre 10-30.

Após a corrida, as lâminas serão retiradas da cuba e colocadas em um suporte horizontal sendo lavadas com solução de neutralização por 5 minutos (procedimento repetido 3 vezes). O DNA será em seguida precipitado em etanol a 100% por alguns segundos e, seco em temperatura ambiente. O armazenamento será feito em caixas para lâminas histológicas, sob refrigeração a 4°C, ou em local seco, sem luminosidade e a temperatura ambiente.

3.2.1.3. Coloração e análise

A coloração será feita com brometo de etídio na concentração de 20µg/mL. Para isso, serão colocados 100µL da solução de uso sobre a lâmina, protegida da luz, coberta com uma lamínula e imediatamente analisadas em microscópio óptico de fluorescência com aumento de 200 a 400X. A coloração poderá se manter razoável por algumas horas, se as lâminas forem mantidas em recipiente umedecido e opaco. Os padrões dos cometas serão analisados por software acoplado ao analisador de imagem. Após a análise, as lamínulas serão retiradas e mergulhadas em etanol a 100% e as lâminas serão armazenadas podendo ser recoradas quando necessário. De acordo com Collins et al., (1997), as células analisadas devem ser classificadas conforme a extensão do dano no DNA, em cinco categorias: sem danos (dano<5%), baixo nível de dano (5-20%), médio nível de dano (20-40%), alto nível de dano (40-95%) e totalmente danificada (dano>95%). De acordo com o comprimento da cauda em relação ao diâmetro da cabeça, os Cometas são classificados em: classe 0 sem cauda, classe 1 com comprimento da cauda menor do que o diâmetro da cabeça do Cometa, classe 2 cauda com comprimento entre 1 e 2 vezes o diâmetro da cabeça do Cometa e classe 3 cauda com comprimento maior que 2 vezes o diâmetro da cabeça do Cometa.



3.3. Análise estatística dos resultados

Os dados obtidos serão analisados estatisticamente, sendo expressos os resultados pela média +/- desvio padrão (SD).



4- Cronograma de execução




Etapas:





  1. Padronização das concentrações adequadas de peçonhas e volumes sanguíneos para a posterior realização da avaliação do potencial Genotóxico da peçonha de Lachesis muta.

  2. Realização de testes do cometa e avaliação das lâminas.

  3. Formatação dos resultados e análise estatística dos mesmos.

  4. Elaboração de manuscritos (relatório; resumo para congresso).







Bimestre letivo/ano

ETAPAS

02/2011

01/2012

1

X




2

X

X

3

X

X

4




X



5- Referências Bibliográficas Fundamentais
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