Desenvolvimento de um protótipo para coleta de m



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DESENVOLVIMENTO DE UM PROTÓTIPO PARA COLETA DE M. tuberculosis EM AEROSSÓIS GERADOS PELA TOSSE
Rosemeri Maurici da Silva1, Letícia Keiko Mori2, Mônica Figueira Scirea2, Maria Luiza Bazzo2, Mariana Chagas2
RESUMO

Objetivo: Desenvolver um protótipo de coleta de M. tuberculosis em aerossóis gerados pela tosse, recuperando-os através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Metodologia: A primeira etapa da pesquisa avaliou a viabilidade da captação do M. tuberculosis presentes em aerossóis gerados pela tosse. Foi desenvolvido um protótipo de coleta utilizando-se o Intersurgical Clear-Therm 3 filter + HME® com um disco FTA (Whatman Bioscience®) sobre o filtro interno. Este protótipo foi testado em uma paciente com tuberculose pulmonar bacilífera, em um período de 8 horas, nos momentos de tosse espontânea. Na segunda etapa foi avaliado o rendimento da recuperação por PCR do M. tuberculosis no material obtido pela tosse e coletado através de três protótipos, em pacientes com tuberculose pulmonar, considerando padrão áureo a baciloscopia e cultura realizadas em amostras de escarro. Resultados: A análise do material coletado na primeira etapa revelou resultado positivo na PCR. Na segunda etapa foram avaliados 28 pacientes. A PCR não apresentou resultados positivos. Conclusão: A recuperação do bacilo pelo primeiro protótipo confirma a efetividade do disco FTA e da PCR, porém os protótipos avaliados na segunda etapa não foram eficazes na recuperação do microorganismo.


Palavras-chave: Aerossóis. Tuberculose. PCR.

1Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências da Saúde da Unisul, Coordenadora do Grupo de Pesquisa em Pneumologia e Semiologia da Unisul (PEGASUS), Doutora em Medicina-Pneumologia.

2 Pesquisadores colaboradores.

INTRODUÇÃO

A transmissão da tuberculose ocorre por disseminação aérea do bacilo, através da tosse, espirro e fala. (SBPT, 2004). Estimativas da Organização Mundial da Saúde (2004) indicam que, a cada ano, 8,2 milhões de novos casos são diagnosticados. (OMS, 2004). O diagnóstico da doença é realizado através da cultura no escarro. (BRASIL.FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2002). A baciloscopia é o método mais utilizado para diagnóstico de probabilidade. O ponto negativo desta técnica é a necessidade de grande quantidade de bacilos para que tenha boa acurácia. (KRITSKI; CONDE; MUZZI DE SOUZA, 2005). A cultura permite identificar a micobactéria mesmo em pequeno número, porém, o resultado só é possível em 3 a 6 semanas. (SBPT, 2004). Muitos pacientes não apresentam expectoração, necessitando de técnicas invasivas, ou da indução de escarro, para a obtenção das amostras respiratórias. (CONDE et al., 2000). Uma das alternativas diagnósticas seria a recuperação do bacilo diretamente do material aerossolizado através da tosse. Apoiados nesta premissa, propusemo-nos a desenvolver um protótipo de coleta de M. tuberculosis em aerossóis gerados pela tosse, recuperando-os pela técnica da PCR.


METODOLOGIA

A primeira etapa do estudo consistiu na avaliação da viabilidade da captação de M. tuberculosis presente em aerossóis gerados pela tosse, e recuperação através da PCR. Foi desenvolvido um protótipo de coleta utilizando-se o Intersurgical Clear-Therm 3 Filter + HME®, com um disco FTA sobre o filtro interno (Protótipo 01). Este foi testado em paciente com tuberculose bacilífera (++), a qual, durante 8 horas, nos momentos de tosse espontânea, levou a extremidade do protótipo à boca e realizou a coleta dos aerossóis.

Na segunda etapa da pesquisa foram desenvolvidos e avaliados três novos protótipos.

O Protótipo 02 consistiu de um copo plástico com um disco FTA em seu interior. Foram avaliados pacientes com tuberculose pulmonar ou com suspeita clínica, no Centro de Atendimento Especializado em Saúde (CAES), em Tubarão – SC. Todos assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Os participantes realizaram coleta de escarro para baciloscopia e cultura, e as amostras foram imediatamente, encaminhadas para a realização de baciloscopia pela técnica de Ziehl-Neelsen e cultura em meio de Löwenstein-Jensen (LJ). No mesmo momento, o participante foi orientado a realizar manobras de inspiração profunda e tossir, por três vezes consecutivas, dentro do Protótipo 02. O mesmo processo foi realizado em 5 pacientes no Hospital Nereu Ramos em Florianópolis – SC, sendo que desta feita, os pacientes deveriam levá-lo à boca toda vez que apresentassem tosse espontânea, durante 24 horas.

O Protótipo 03 consistiu de uma máscara cirúrgica com um disco FTA em seu interior. Os participantes, em número de 5, foram orientados a usá-lo por um período de 24 horas, no Hospital Nereu Ramos – Florianópolis – SC.

O Protótipo 04 foi desenvolvido através da inversão do fluxo de ar de um nebulizador, adaptando-o ao Protótipo 01, criando um sistema de vácuo. O mesmo foi entregue a cinco pacientes portadores de tuberculose no Hospital Nereu Ramos. Estes foram orientados a ficar com o protótipo por um período de 8 horas, e acionar o mecanismo de vácuo, levando o protótipo à boca, em todos os momentos que apresentassem tosse espontânea.

De cada amostra fixada no papel filtro FTA foram feitos dois cortes de 3mm de diâmetro. Os cortes foram colocados em tubos para PCR de 200 ml. Foram adicionados, a cada tubo, 200 ml do reagente de purificação RP e após homogeneização os tubos foram incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Decorrido este tempo, o RP foi totalmente removido e descartado. O processo de adição do RP, homogeneização, incubação e remoção do RP foi repetido mais duas vezes. Após a última remoção do RP foram adicionados, a cada tubo, 200 ml de TE (10mM Tris/Cl; 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Os tubos foram homogeneizados e incubados a temperatura ambiente por 5 minutos e ao final da incubação o TE foi removido. As etapas de adição do TE, homogeneização, incubação e remoção do TE foram repetida mais uma vez. Após a última remoção, os discos secaram à temperatura ambiente durante uma hora e foram utilizados como molde (DNA) na reação de PCR. Fragmentos dos discos FTA do Protótipo 02 com 24 horas de avaliação e do Protótipo 03 foram semeados em cultura, e realizada a PCR do meio no 17o dia de semeadura.

O projeto de pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa em Seres Humanos da Unisul, e aprovado sob o protocolo número 08.437.4.01.III.


RESULTADOS

A análise do material coletado na primeira etapa da pesquisa revelou resultado positivo na PCR para M. tuberculosis. Confirmada a possibilidade de recuperação do bacilo, foi iniciada a segunda etapa da pesquisa.

O Protótipo 02 foi avaliado em 18 pacientes com suspeita de tuberculose, dos quais 5 foram excluídos, pois não tinham expectoração. Dos 13 restantes, 9(69,2%) eram do gênero masculino, e a média de idade foi de 37,6 anos. Foram realizadas 13 baciloscopias, com 3(23,1%) resultados positivos. A cultura foi realizada em 7 pacientes, com 5(71,4%) resultados positivos. Dos 7 pacientes que realizam ambos os exames, 5(71,4%) tiveram resultados compatíveis com tuberculose. Esses foram positivos, tanto na baciloscopia como na cultura, em 3(42,8%) pacientes; negativos em 2(28,6%), e os outros 2(28,6%) foram recuperados somente na cultura. A PCR dos 13 pacientes teve resultados negativos.

Resultados da avaliação do Protótipo 02 durante 24 horas e do Protótipo 03.

Foram avaliados 10 pacientes com tuberculose, todos do gênero masculino, e com média de idade de 41 anos. Foram realizadas 10 baciloscopias, com 4(40%) resultados positivos +++, 2(20%) resultados positivos ++, 2(20%) resultados positivos +, e 2 resultados (20%) negativos. Dos 4 pacientes que realizaram ambos os exames, 2(50%) tiveram resultados compatíveis. A técnica por PCR apresentou resultados negativos, assim como as culturas de fragmentos dos discos FTA.

O Protótipo 04 também não foi efetivo na recuperação de M. tuberculosis pela técnica de PCR.
DISCUSSÃO

Os resultados demonstram que a recuperação do bacilo através da PCR em aerossóis é factível em pacientes bacilíferos e que realizem a coleta por longo período de tempo (8 horas); porém, a recuperação não foi reprodutível utilizando três manobras de tosse, no Protótipo 02. Da mesma forma, a recuperação não foi possível com período de tempo de coleta de 24 horas, nem com o uso de máscaras que aumentam a superfície de contato, e com o uso de mecanismo de vácuo.

Nardell (2004) comenta que muito pouco ainda se sabe sobre a aerobiologia da tuberculose. Afirma que capturar aerossóis que são naturalmente eliminados por pacientes bacilíferos ainda não foi possível.(NARDELL, 2004).

A pequena quantidade de bacilos eliminados em aerossóis pode ser responsável pelos resultados negativos descritos. A hipótese de que um maior tempo de coleta pudesse gerar maior número de partículas e melhorar a sensibilidade da técnica, não foi confirmada.

Fennely e colaboradores (2003), desenvolveram um método para a cultura de M. tuberculosis em aerossóis gerados pela tosse. Vinte e cinco por cento dos pacientes foram positivos, em relação à baciloscopia. A recuperação ocorreu após crescimento em cultura, o que amplia a sensibilidade. Mesmo assim, somente um quarto dos pacientes teve o material recuperado. A cultura do material coletado no presente estudo não resultou positiva, nem tampouco a PCR realizada no 17o dia de cultura.

Guio e colaboradores (2006), demonstraram que os cartões FTA analisados por PCR têm como vantagens a coleta, o transporte e o processamento das amostras de escarro. O material bacilar permanece, por seis meses, no cartão, e a análise por PCR é rápida. Comparando os protótipos analisados com este estudo feito em amostras de escarro, pode-se inferir que o material obtido pode ter sido insuficiente. A intensidade e o número de tossidas para captura de partículas pode ser significante, visto que o tempo em que o paciente esteve com o protótipo não tenha influenciado os resultados.

Wan e colaboradores (2004) realizaram cultura no ar filtrado de ambiente hospitalar, e analisaram o material por PCR. O método de filtragem mostrou-se eficaz em detectar M. tuberculosis, resultado também demonstrado por outros autores. (MASTORIDES et al.,1999).

A distância entre a boca e o disco FTA, o processo de seleção aleatória dos fragmentos de disco que foram submetidos à PCR e posterior cultura, que pode ter sido responsável pela análise de fragmentos de disco sem amostra bacilar de fato, são fatores que podem ter influenciado os resultados. Outro aspecto conceitual que deve ser analisado é o de que para a transmissão da tuberculose há necessidade de um contato íntimo e prolongado, ou seja, transmissor e receptor devem estar próximos e por longos períodos de tempo no mesmo ambiente. A dificuldade de reprodutibilidade desta condição pode ser responsável pelos resultados aqui descritos.


AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica do Estado de Santa Catarina (FAPESC), através do edital PPSUS2006.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRASIL. FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE. Tuberculose: Guia de Vigilância Epidemiológica. Brasília: Ministério de Saúde, 2002.
CONDE, Marcus Barreto; et al. Comparison of sputum induction with fiberoptic bronchoscopy in the diagnosis of tuberculosis. Experience at an AIDS reference center in Rio de Janeiro, Brazil. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Stanford, v. 162, n. 6, p. 2238-2240, dec. 2000.
FENNELLY, Kelvin P.; et al. Cough-generated aerosols of Mycobacterium tuberculosis: a new method to study infectiousness. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Stanford, v. 169, n. 5, p. 604-609, dec. 2003.
GUIO, H.; et al. Method for efficient storage and transportation of sputum specimens for molecular testing of tuberculosis. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Paris, v. 10, n. 8, p. 906-910, oct. 2006.
KRITSKI, Afrânio Lineu; CONDE, Marcus Barreto; MUZZY DE SOUZA, Gilvan R. Tuberculose: do ambulatório à enfermaria. 3. ed. Rio de janeiro: Atheneu, 2005.
MASTORIDES, Stephen M.; et al. The detection of airborne Mycobacterium membrane air sampling and polymerase chain reaction. Chest, Washington, v. 115, n. 1, p. 19-25, jan. 1999.
NARDELL, Edward A. Catching Droplet Nuclei: Toward a Better Understanding of Tuberculosis Transmission. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Stanford, v. 169, n. 5, p. 553-554, march 2004.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Global Tuberculosis Control: Report 2004. Genebra:OMS, 2004.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA. II Diretrizes Brasileiras para Tuberculose 2004. Jornal Brasileiro de Pneumologia, São Paulo, v. 30, suppl. 1, p. 1-57, jun. 2004.
WAN, Gwo-Hwa; Lu, Shu-Chuan; Tsai, Ying-Huang. Polymerase Chain Reaction used for the detection of airborne Mycobacterium tuberculosis in health care settings. American Journal of Infection Control, Washington, v. 32, n. 1, p. 17-21, feb. 2004.






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