Daniel Moreira dos Santos Purificação e caracterização farmacológica parciais das peçonhas das aranhas Lycosa erythrognatha



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Daniel Moreira dos Santos

Purificação e caracterização farmacológica parciais das peçonhas das aranhas Lycosa erythrognatha e Lycosa sp.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Elena de Lima Perez Garcia

Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo Porto Bemquerer

Co-orientador: Prof: Dr. Jader dos Santos Cruz

Monografia submetida ao Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Bioquímica e Imunologia.



Este trabalho foi realizado no Laboratório de Venenos e Toxinas Animais e no Laboratório de Membranas Excitáveis, Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.

Agradecimentos



  • Aos meus pais pelo apoio durante esse anos de curso.

  • À profª Maria Elena pelo apoio, ensinamentos e confiança deposita em mim para a realização desse trabalho.

  • Ao Prof. Marcelo Bemquerer, pelo ensinamentos e disponibilidade em ajudar.

  • Ao prof. Jader Cruz e a Roberta pela inestimavem ajuda nos experimentos de eletrofisiologia e a todos do laboratório de membranas excitáveis pela receptibilidade.

  • Ao prof. Mário De Maria e a Éder pela criação e identificação das aranhas.

  • Aos meus amigos do Laboratório de Venenos e Toxinas Animais, Adriano, Alessandra, Carla, Flávia, Glauco, Julinho, Leida, Luciene, Malu, Márcia, Raquel, Sabrina, pela ajuda, amizade, e momentos agradaveis proporcionados.

  • À D. Zulema e Júlio Cezar por inestimável apoio técnico

  • À equipe de Tróia (Helena, Lu, Psico e Rubens), pela amizade e pelas cervejas.

  • E a todos que de alguma forma tornaram esse trabalho possível.

Índice

Resumo 6

  1. Introdução 7

    1. Biologia das aranhas. 8

    2. As tarântulas 10

    3. Venenos e toxinas de aranhas 11

    4. Toxinas e o canal de sódio 16

    5. Lycosa erythrognatha 19

  2. Objetivos 22

    1. Objetivos gerais 23

    2. Objetivos específicos 23

  3. Materiais e métodos 24

    1. Drogas e reagentes 25

    2. Coleta das aranhas 25

    3. Obtenção do veneno 26

    4. Dosagem de proteína 26

    5. Bioensaios 27

      1. Ensaios em camundongos 27

      2. Ensaios em moscas domésticas 27

    6. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-Tricina 28

      1. Soluções 28

      2. Procedimentos 30

    7. Cromatografia de fase reversa em sistema HPLC 32

      1. Soluções 32

      2. Programas 32

    8. Estudo eletrofisiológico 34

      1. Cultivo celular 34

      2. Eletrofisiologia 35

  4. Resultados 38

    1. Aranhas 39

    2. Dosagens dos venenos das aranhas 39

    3. Efeito do veneno de Lycosa erythrognatha e Lycosa sp em camundongos e em moscas. 40

      1. Bioensaio em camundongos 40

      2. Bioensaio em moscas domésticas 40

    4. Perfis eletroforético e cromatográfico do veneno de Lycosa erythrognatha e de Lycosa sp 41

      1. Comparação da composição do veneno de Lycosa erythrognatha e Lycosa sp 41

      2. Variações na composição do veneno de Lycosa erythrognatha 45

    5. Estudos eletrofisiológicos do veneno de L. erythrognatha em células GH3 49

      1. Efeito do veneno de L. erythrognatha sobre as correntes de Na+ e K+ 49

      2. Efeito do veneno de L. erythrognatha sobre a relação corrente voltagem 54




  1. Discussão 56

  2. Conclusões 60

  3. Perspectivas 62

  4. Referências bibliográficas 64


Resumo

As aranhas do gênero Lycosa são muito comuns na região sudeste, podendo ser encontradas mesmo nas proximidades de residências. Seus venenos são pouco estudados e o conhecimento de seus componentes ativos pode ser interessante para a revelação de novos fármacos, inseticidas ou mesmo de moléculas que sirvam como sondas para estudos bioquímicos, envolvendo estrutura e função de receptores, canais iônicos, enzimas proteolíticas, antibióticos e outras classes funcionais. Neste trabalho iniciamos a caracterização do veneno da L. erythrognatha e de Lycosa sp. Utilisando-se cromatografia de fase reversa em HPLC (coluna Supelco C18), verificamos diferenças significativas nas concentrações de alguns componentes do veneno em relação a espécimes machos e fêmeas, jovens e adultos, e quanto à época de extração. Experimentos de “patch clamp” whole-cell, em células GH3, com veneno total de fêmeas adultas de L. erythrognatha, demonstraram deslocamento para potenciais mais negativos da dependência de potencial para a ativação dos canais de sódio, similar àquele verificado para toxinas do tipo beta, de escorpiões. É a primeira vez que este efeito é descrito para o veneno de Lycosa, estudos prévios com aranhas relacionadas a esta espécie mostram sobretudo, efeito do tipo alfa.



  1. INTRODUÇÃO


    1. Biologia das aranhas.


As aranhas são animas pertencentes ao filo arthropoda, sub-filo Chelicerata, classe Arachnida. A classe Arachnida compreende cerca de 40 mil espécies descritas (GRISHIN, 1996).

As aranhas estão distribuídas em praticamente toda a superfície terrestre, sendo mais raras nas tundras e estepes das regiões polares e sub-polares de ambos os hemisférios, atingindo as maiores densidades nas regiões de clima tropical e subtropical onde povoam selvas, campos, planícies e plantações (CODDINGTON e LEVI, 1991).

A maior parte das aranhas são relativamente pequenas (2-10mm de comprimento corporal), mas as grandes tarântulas podem atingir de 80 a 90mm de comprimento corporal. Os machos normalmente são menores e possuem vida mais curta que as fêmeas (BARNES, 1990).

A maioria das espécies são inofensivas prestando serviço à agricultura, sendo excelentes controladoras de população de insetos predadores em grandes plantações. Há contudo, algumas aranhas, que são bastante venenosas, causando sérios problemas ao homem.

Segundo a natureza de seus hábitos, as aranhas distinguem-se em subterrâneas, terrículas, lapidícicolas, cavernículas, dendrícolas, errantes, adaptadas à vida subaquática ou às margens das águas e até marinhas. Todas são carnívoras e preferem caçar a sua presa viva, matá-las e comê-las, sugando as partes líquidas da mesma.

Para se apoderarem das presas, há dois métodos: o primeiro consiste em ver, pressentir, atrair ou caçar a vítima; saltar sobre a mesma, segurá-la com as garras das pernas, encravar as duas pinças veneníferas e matá-las com o veneno. As aranhas que agem dessa forma necessitam ter um veneno potente, uma boa visão e uma grande agilidade de salto; não constróem teias, são quase sempre errantes, caçadoras e costumam andar sozinhas. Este grupo compreende entre outras as caranguejeiras, as Phoneutriae, Tarântulas e as “papa-moscas”. O segundo método consiste na construção de uma teia onde os insetos alados, se tornam presas fáceis. Fazem parte desse grupo as aranhas dos gêneros Argiope, Araneus, Nephila, Tityphantes, Teutana, Dictyna e as tetragnatas, entre outras.

As principais aranhas causadoras de acidentes no Brasil são:

As tarântulas do gênero Lycosa, LATREILLE 1804.

As Armadeiras do gênero Phoneutria, PERTY 1833.

As aranhas marrons do gênero Loxoceles, HEINECKEN e LOWE 1831.

As viúvas-negras do gênero Lactrodectus, WALCKANAER 1805.

Segue-se breve descrição sobre as tarântulas, as quais pertence o gênero Lycosa, objeto deste trabalho.

    1. As tarântulas


Pertencem à família Lycosidae, são conhecidas como aranhas-lobo, aranhas de jardim, podem ser encontradas em todas as regiões tropicais, subtropicais, em zonas temperadas e mesmo em regiões onde cai neve. Apresentam capacidade de adaptação ao meio ambiente muito grande, podendo ser encontradas a 3 mil metros de altura e ao nível do mar, em terreno arenoso ou em pântanos. Mais de 2200 espécies são encontradas em todo mundo e cerca de 120 no Brasil. As mais comuns são: Lycosa auroguttata, KEYSERLING 1891, Lycosa erythrognatha, LUCAS 1836, Lycosa nychethemera, BERTKAU 1880 e a Lycosa ornata, PERTY 1833 (BÜCHERL, 1980)

As tarantulas podem ser reconhecidas pelo arranjo característico de seu olhos: quatro pequenos na fileira anterior, dois grandes e dois medianos na fileira posterior (FOELIX, 1996). As espécies de Lycosa vivem de 16 a 20 meses na natureza e em laboratório de 24 a 29 meses (BÜCHERL, 1971).

As aranhas do gênero Lycosa não constróem teias, são ágeis caçadoras e se alimentam principalmente de pequenos insetos, como grilos e gafanhotos. Agarram sua presa pulando sobre ela envolvendo-a com seu primeiro par de patas e os palpos e inserindo sua quelícera completamente distendida na vítima. Podem sobreviver 4 meses sem alimento (BÜCHERL, 1971). São encontradas principalmente em campos, gramados de jardim, à beira de piscinas, riachos e lagoas, podendo ser encontradas também, com certa freqüência, na proximidade de domicílios. Algumas espécies cavam buracos onde podem se esconder, outras podem viver em água parada poucas constróem teias.

Durante o acasalamento ou chuvas, que as obrigam a mudar, ficam errantes podendo penetrar em residências.

A ação geral do veneno, na maioria das vezes, é fraca e resulta principalmente, de uma atividade proteolítica, produzindo tolerável dor local, às vezes um pouco tardia, tumefação do local da picada, vermelhidão, arroxeamento e pequena ferida com extravasamento do líquido celular.



    1. Venenos e toxinas de aranhas


A peçonha das aranhas é o produto de secreção de um par de glândulas situadas na região anterior do cefalotórax (todos as aranhas exceto a família Uloboridae possuem esse par de glândulas), utilisada para paralisar sua presa. A imobilização é certamente a função primária do veneno, o efeito letal é unicamente secundário (FRIEDEL, 1989).

Das 40.000 espécies de aranhas conhecidas, apenas um pequeno número foi investigado quanto à composição e às propriedades dos venenos. Os mesmos são constituídos de uma grande variedade de toxinas protéicas e peptídicas (SCHULZ e cols, 1997), muitas das quais possuem de três a sete pontes dissulfeto (GRISHIM, 1999), podendo também apresentar acilpoliaminas, aminoácidos, enzimas proteolíticas, sais (Ca+, K+, Mg2+, Na+ e Cl-) (ESCOUBAS e cols 2000), ácidos nucleicos (ATKINSON e cols, 1992), além de alguns fatores humorais como serotonina (WELCH e cols, 1963), GABA (SCHANBACHER e cols, 1973) e histamina (DINIZ, 1963). Há uma considerável heterogeneidade protéica entre os venenos de uma mesma espécie, variando entre machos e fêmeas, jovens e adultos, e quanto à época de extração (BINFORD, 2001). A maioria dos componentes tóxicos são estáveis ao calor e ao pH, entretanto há outros componentes que são extremamente lábeis. A obtenção de quantidades suficientes de material (sem secreções digestivas, hemolinfa ou “debris” de glândulas de veneno) tem sido um dos principais obstáculos para o estudo das substâncias ativas dos venenos das aranhas (ATKINSON e cols, 1992).

Apesar de quase todas as espécies de aranhas serem venenosas somente cerca de 20-30 das 40.000 espécies são perigosas para o homem (FOELIX, 1996).

Do ponto de vista biológico, o veneno das aranhas é primariamente empregado para paralisar a presa, picadas defensivas contra grande animais (incluindo o homem) são secundárias. Algumas aranhas possuem venenos muito ativos, essa categoria de aranhas geralmente ataca presas perigosas como aranhas e vespas. Outras aranhas possuem venenos muito menos ativos, nesse grupo estão as tecedeiras que produzem teias simétricas.

Até 1980, estudos mais aprofundados de venenos de aranhas visavam principalmente, os de aranhas do gênero Lactrodectus (viúvas-negras) e do gênero Attrax, demonstrando a presença de toxinas que afetam o sistema nervoso de vertebrados. A partir da década de 80, o número de trabalhos com venenos de aranhas aumentou consideravelmente. Trabalhos com classes distintas de artrópodes, dentre eles, escorpiões (WATT, 1994, DE LIMA e MARTIN-EAUCLAIRE, 1995) e vespas (PIEK 1986), mostraram que o veneno destes animais têm ação em tecidos excitáveis de diversas espécies. Toxinas de escorpião se ligam a canais de sódio de membranas excitáveis de insetos (PELHATE, 1982; GORDON ,1985; DE LIMA, 1986, 1989, p/revisão ver: DE LIMA & MARTIN-EAUCLAIRE, 1995, ZLOTKIN e cols., 2000), crustáceos (GORDON, 1984) e mamíferos (CATTERAL, 1980, DE LIMA & MARTIN-EAUCLAIRE, 1995) sendo ferramentas importantes para o estudo do sistema nervoso de invertebrados e de vertebrados. Com a ajuda de toxinas de venenos de escorpiões foi determinada a estrutura de canais de potássio com a identificação da região do poro do canal (MACKINNON e Cols, 1989) e de sua estrutura tetramérica (MACKINNON e Cols, 1991). Uma outra tendência foi a descoberta feita por KAWAI (1982) de que o veneno de algumas aranhas, que não são de importância médica, também podem conter neurotoxinas que agem no sistema nervoso de vertebrados. Há também as toxinas de baixo peso molecular, que agem no sistema glutamatérgico de vertebrados e de invertebrados e que podem funcionar como inseticidas biológicos (p/revisão ver: ZLOTKIN e cols., 2000; JACKSON, 1989, FIGUEREIDO e cols, 1995).

A partir do veneno de uma tarântula (Lycosa carolinensis), encontrada nos Estados Unidos, YAM & ADAMS (1998) isolaram peptídeos de cerca de 30 resíduos, que mostraram ação antibacteriana e foram capazes de promover a liberação de cálcio de sinaptosomas. Esta não é uma descoberta surpreendente, uma vez que existe uma grande semelhança estrutural entre algumas toxinas e uma classe de peptídeos antimicrobianos (DIMARQ, 1999).

Toxinas presentes na peçonha de aranhas são classificadas quimicamente em dois grandes grupos: acilpoliaminas e peptídeos ricos em cisteína.

As acilpoliaminas são toxinas de baixo peso molecular (300 a 700 Da), presentes principalmente, no veneno de aranhas que constróem teias e de caranguejeiras (CABBINESS e cols, 1980; QUISTAD e cols, 1990). Estas poliaminas apresentam estrutura básica formada por uma poliamina alifática (semelhante a cadaverina e a espermina), um grupo cromóforo (fenólico ou indólico), e na maioria das vezes, um aminoácido. Este tipo de toxina foi descrito pela primeira vez na peçonha da aranha japonesa Nephila clavata por KAWAI (1982). As acilpoliaminas apresentam ação farmacológica bloqueando os receptores de glutamato, assim o principal efeito na membrana pós-sináptica, é o bloqueio dependente da abertura de canais iônicos da junção neuromuscular de invertebrados e no sistema nervoso central de mamíferos. A presença de altas concentrações de glutamato livre e dos antagonistas de receptores de glutamato na peçonha de aranhas constitui-se um mecanismo sofisticado e poderoso para imobilizar a presa (EARLY & MICHAELIS, 1987).Também agem de forma semelhante no receptor NMDA (N-metil D-aspartato) e não NMDA do sistema nervoso central de mamíferos (ABE e cols, 1983).

Toxinas peptídicas têm sido identificadas na peçonha de várias espécies de aranhas, elas consistem de cadeia de 30 à 77 resíduos de aminoácidos, com alto conteúdo de resíduos de cisteína, que representam em média 20% da molécula. O peso molecular varia de 3500 – 8500, e normalmente afetam canais iônicos.

Nosso grupo vem estudando algumas toxinas peptídicas isoladas da peçonha da aranha Phoneutria nigriventer. (FIGUEIREDO e cols, 1995; FIGUEIREDO e cols, 2001, DE LIMA e cols, 2001). Recentemente trabalho em nosso laboratório mostrou que uma toxina peptídica da aranha P. nigriventer bloqueia a corrente iônica do receeptor glutamatérgico do tipo NMDA, em neurônios de rato (FIGUEIREDO e cols, 2001). Outra toxina deste mesmo veneno, TX4(6-1), rertarda a inativação de canais de Na+ de axõnio de baratas (DE LIMA e cols, 2001)

As toxinas peptídicas presentes na peçonha de aranhas não mostram homologia com toxinas identificadas na peçonha de outros artrópodes, embora a presença de 4 pontes dissulfeto seja comum nas agatoxinas, robustoxinas e versutoxinas e em toxinas de muitos escorpiões.


Neurotoxinas
As neurotoxinas são toxinas que afetam o sistema nervoso, agindo diretamente em suas células (atuando sobre canais iônicos neuronais) e/ou afetando a comunicação entre neurônios e suas células alvo (atuando sobre a liberação de neurotransmissores). Fisiologicamente, o sistema nervoso controla a maioria das funções vitais do organismo e qualquer alteração neste sistema acarreta sérias conseqüências. Quimicamente são muito diversas e estão presentes em uma grande variedade de organismos marinhos e terrestres, são consideradas um grupo muito importante, atuando como ferramenta molecular na descoberta de novas estruturas e modelos de transmissão sináptica, tanto a nível periférico como ferramenta molecular na descoberta de novas estruturas e modelos no sistema fisiológico de vertebrados e de invertebrados (ADAMS & OLIVEIRA, 1994, GARCIA & KACZOROWSKI, 2001).

A ação direta das toxinas nos canais iônicos, talvez seja o alvo mais importante, uma vez que os canais de sódio, potássio e cálcio são essenciais na condução do potencial de ação bem como na liberação de neurotransmissores.




    1. Toxinas e os canais de sódio.

O papel central das correntes de sódio é gerar o potencial de ação. O deflagrar do potencial de ação é resultado do aumento da condutância ao sódio, o qual produz uma mudança no potencial de membrana de um ponto próximo ao potencial de equilíbrio do potássio (Vk= -90mV) para um potencial próximo ao equilíbrio do sódio (VNa= +60mV). Esse aumento de condutância é efêmero, com duração de milisegundos e então o canal é inativado espontaneamente, permitindo a repolarização de membrana, à medida que a permeabilidade ao potássio predomina novamente.

A despolarização causa uma abrupta mudança dos canais de sódio do estado fechado para o estado aberto. Após permanecer aberto por um período variável de tempo, o canal de sódio passa rapidamente para um estado inativado e permanece inativado até que a membrana seja repolarizada novamente.

O canal de sódio é uma glicoproteína transmembrana, constituída de uma subunidade , com aproximadamente 260 kDa que pode estar associada a subunidades modulatórias 1 (36KDa) ou 2 (33 KDa). Estruturalmente a subunidade  possui 4 domínios homólogos (I-IV), que cercam o poro central e cada domínio possui 6 segmentos transmembrana (S1-S6). Entre os segmentos S5 e S6 de cada domínio há uma região chamada alça P, ou segmento SS1-SS2 que se invagina na membrana formando as paredes do poro.



Atualmente são descritos 6 sítios de ligação no canal de sódio (fig. 2), identificados a partir de estudos bioquímicos, eletrofisiológicos e farmacológicos (P/ revisão ver: CATTERAL, 1992; CESTÈLE & CATTERALL, 2000).

  • Sítio 1: Local de ligação da tetrodotoxina, saxitoxina e -conotoxina. Estas toxinas ligam-se próximo à entrada externa do canal e bloqueiam o fluxo iônico, tanto pela oclusão física do canal, quanto por uma mudança conformacional da proteína.

  • Sítio 2: Ligação de toxinas solúveis em lípides, incluindo batracotoxina, veratridina e grainotoxina. Estas toxinas mudam a dependência de voltagem da ativação do canal em direção a hiperpolarização e previnem a inativação deste, resultando em ativação do canal, mesmo em potenciais de membrana próximos do repouso.

  • Sítio 3: Ligação de toxinas do tipode escorpião e de toxinas de anêmonas do mar. Estas toxinas retardam ou bloqueiam a inativação do canal.

  • Sítio 4: Sítio de ligação das toxinas do tipo  de escorpião. A ligação das toxinas do tipo  não depende de voltagem. Estas toxinas ligam-se no lado extracelular do canal e alteram a dependência de voltagem do canal.

  • Sítio 5: Sítio de ligação das brevetoxinas e ciguatoxinas. Estas toxinas ligam-se externamente ao canal acentuando a sua atividade.

  • Sítio 6: Sítio de ligação das -conotoxinas. A ligação dessas toxinas ao canal causam um marcante prolongamento do potencial de ação. O local exato de ligação dessas toxinas ainda não foi determinado.





Fig. 1. Arranjo proposto da subunidade do canal de sódio. (A) Mapa funcional da subunidade  do canal de sódio, onde o poro é representado em vermelho, o sensor de voltagem em amarelo e a região inativadora em azul. (B) Localização dos sítios de ligação das neurotoxinas no canal de sódio de mamíferos (extraído de Cèstelle & Catterall, 2000).



    1. Lycosa erythrognatha

A espécie Lycosa erytrhognatha (FIG. 2), pode ser encontrada com relativa facilidade na região sudeste do Brasil, podendo ser encontrada nas proximidades de residências. A sua classificação pode ser vista abaixo.




SUPER-REINO

Eukaryota

REINO

Metazoa

FILO

Arthropoda

SUB-FILO

Chelicerata

CLASSE

Arachnida

ORDEM

Araneae

SUB-ORDEM

Araneomorphae

SUPERFAMÍLIA

Lycosoidea

FAMÍLIA

Lycosidae

GENERO

Lycosa

ESPÉCIE

Lycosa erythrognatha

Tabela 1. Classificação da aranha Lycosa erythrognatha.

O gênero Lycosa, embora não seja considerado potencialmente perigoso para a espécie humana, tem alta freqüência de casos de acidentes relatados na literatura, com descrição principalmente de dor no local da picada (LUCAS, 1988).

O único trabalho com dados eletrofisiológicos sobre o veneno dessa aranha foi publicado por CRUZ e cols (1994) onde foi demonstrado que uma fração do veneno (LycIV) apresenta efeito similar a toxinas do tipo  de escorpião em preparações de nervoso isquiático de rã.



Este veneno é pouco estudado e o conhecimento de seus componentes, farmacologicamente ativos, pode ser interessante para a revelação de novos fármacos (ex. antibióticos), inseticidas, enzimas proteolíticas, ou mesmo de moléculas que sirvam como sondas para estudos bioquímicos, envolvendo estrutura e função de receptores e de canais iônicos.



  1. OBJETIVOS



2.1- Objetivo

O objetivo desse trabalho foi iniciar a purificação e a caracterização farmacológica do veneno de Lycosa erythrognatha e Lycosa sp.


2.2- Objetivos específicos.



  • Comparar os perfis cromatográficos dos venenos de Lycosa erythrognatha e de Lycosa sp.

  • Comparar os perfis cromotográficos dos venenos de Lycosa erythrognatha em relação a espécimes: machos e fêmeas, jovens e adultos e quanto à época de extração.

  • Verificar a ação do veneno total de Lycosa erytrhognatha em mosca doméStica e em camundongos.

  • Verificar a ação do veneno de Lycosa sp em mosca domética.

  • Verificar a ação do veneno de Lycosa erythrognatha em células GH3, por técnicas eletrofiológicas.



  1. MATERIAIS E MÉTODOS



3.1- Drogas e reagentes

Todos os produtos químicos utilizados foram de grau analítico, procedentes da Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Chemical Company (Saint Louis, USA) e Aldrich Chemical Company (Milwaukee, USA).

Aos reagentes utilizados na cromatografia foram de grau HPLC procedentes da Merck (acetonitrila) e Fluka (TFA = ácido trifluoracético).



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