ClpB é induzida em resposta a estresse causado por choque térmico e antibióticos na bactéria patogênica Acinetobacter baumannii



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ClpB é induzida em resposta a estresse causado por choque térmico e antibióticos na bactéria patogênica Acinetobacter baumannii
Elaine Luzia dos Santos(PIBIC/CNPq/Unioeste), Juliana Moço Corrêa, Eduardo Alexandre Loth, Rinaldo Ferreira Gandra, Rita de Cássia Garcia Simão(Orientador), e-mail: rita.simao@unioeste.br
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas/Cascavel, PR
Grande área e área: Ciências da Saúde – Medicina
Palavras-chave: Acinetobacter baumannii, ClpB, Western Blot.
Resumo
Acinetobacter baumannii é uma bactéria Gram-negativa que causa severas doenças infecciosas em pacientes imunocomprometidos. A exposição a antibióticos pode levar a resposta a estresse e induzir proteínas de choque térmico em bactérias. O objetivo deste trabalho foi produzir um anticorpo policlonal em coelho usando a proteína recombinante ClpB de A. baumannii como antígeno e usá-lo como ferramenta molecular para averiguar em células da mesma espécie bacteriana a expressão da proteína ClpB em resposta a estresse causado por choque térmico e antibióticos. O anticorpo gerado revelou por ensaios de Western Blot que a expressão de ClpB foi induzida em nível de tradução quando as células da cepa ATCC 19606 foram submetidas a tratamento por choque térmico e aminoglicosídeo. Em adição, quando as células multirresistentes a antibióticos de A. baumanni (cepa RS4) foram submetidas à concentrações sub-inibitórias de ampicilina + sulbactam ou meropenem também mostraram indução da expressão de ClpB. Estes dados sugerem que a proteína ClpB pode ter um papel importante na resposta a estresse causado por antibióticos, e pode figurar como um alvo interessante para o desenvolvimento de novos fármacos.
Introdução

A resistência aos agentes antimicrobianos pode ser o principal fator subjacente a disseminação de A. baumannii o que é considerado extremamente difícil erradicar do cenário clínico. O gene clpB de choque térmico é indutível e necessário para a tolerância celular a uma variedade de estresses incluindo o calor, choque osmótico, etanol, bem como o estresse a ácido. Além disso, ClpB foi implicada na expressão dos fatores de virulência em diferentes espécies de bactérias patogênicas. Em um estudo realizado por Cardoso et al., 2010 verificou-se a expressão dos genes dnaK e groEL em nível de transcrição e tradução, na presença de antibióticos, e os resultados demonstraram que as chaperones GroEL e DnaK podem ter um papel importante durante a resposta ao estresse causado por antibióticos em A. baumannii. O presente trabalho objetivou produzir um anticorpo policlonal contra a proteína recombinante ClpB de Acinetobacter baumannii para avaliar a expressão da proteína em resposta a estresse causado por choque térmico e antibióticos.


Materiais e Métodos
O anticorpo policlonal foi produzido em coelho de acordo com o descrito em Corrêa et al. (2012). As culturas estoque de Acinetobacter baumannii (ATCC 19606) e RS4 (Cardoso et al., 2010) foram crescidas em meios de cultura sólido ou líquido LB (Luria-Bertani) (Bacto-triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1% pH 7,5) acrescido dos antibióticos necessários, a 37 oC para condições ótimas de crescimento ou a 45oC quando A. baumannii ATCC19606 for submetida a choque térmico e 50 oC quando for submetida a choque térmico extremo. Foram utilizados antibióticos da classe dos aminoglicosídeos (estreptomicina a 200 g mL-1) -lactâmicos (Ampicilina + sulbactam a 30/12 g mL-1, respectivamente) e carbapênicos (meropenem a 18 g mL-1) em concentrações sub-inibitórias (Cardoso et al., 2010) para crescimento bacteriano para gerar o estresse causado por antibiótico durante 0, 20 e 40 minutos de incubação. As células submetidas a diferentes estresses foram coletadas por centrifugação (12.000 X g) e ressuspensas em tampão de amostra para eletroforese desnaturante (SDS-PAGE). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose usando o sistema molhado da BioRad®. As membranas de nitrocelulose contendo as proteínas foram bloqueadas por 20-30 minutos em TBS (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; NaCl 150 mM), com adição de leite 0,5%. Após este período, as membranas foram incubadas com TBS-leite contendo o anti-soro anti ClpB diluído 100 vezes. Após a incubação, as membranas foram lavadas por 5 minutos duas vezes em TBS-T (TBS contendo Tween 20 0,05%) e uma vez em TBS, procedendo-se então a incubação com o anticorpo secundário anti IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina, seguida de nova lavagem como descrito acima e revelação com os substratos cromogênicos NBT (nitroblue tetrazolium; 0,15 mg/mL) e BCIP (5-bromo-4-cloro-6-indolil fosfato; 0,3 mg/mL) em tampão Tris-HCl 10 mM pH 9,0; NaCl 100 mM e MgCl2 5 mM.
Resultados e Discussão
A figura 1A mostra o gel de eletroforese SDS-PAGE 9% contendo extratos totais de E. coli com diferentes tempos de indução da proteína ClpB recombinante de A. baumannii. Um gel adicional contendo os mesmos extratos foi preparado e as proteínas totais transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada com anti-soro anti-ClpB produzido em coelha na diluição de 100 vezes em tampão TBS-leite durante 24 horas a temperatura ambiente. A associação antígeno (ClpB -rec) e anticorpo foi verificada (Figura 1B).

Group 5

Figura 1- (A) SDS-PAGE 9% de células de E. coli que superexpressa a ClpB truncada de A. baumannii. (M) Marcador 10KDa Protein Ladder. (T0) Tempo zero de indução da proteína recombinante com IPTG. (T3) Extrato total obtido após 3 horas de indução com IPTG. (B) Western Blot realizado com o anticorpo policlonal anti-ClpB.
A figura 2A evidencia a indução da proteína ClpB de A. baumannii, sendo induzida de maneira crescente em temperaturas mais elevadas de choque térmico. A densitometria da banda gerada no ensaio mostrado na figura 2A evidencia claramente que os níveis da proteína aumentam cerca de 4 vezes quando submetidas a 10 minutos de choque térmico a 45C e quase 10 vezes quando submetida a choque térmico extremo (Figura 2B).
Group 18
Figura 2- (A) Ensaio de Western Blot com o anticorpo policlonal anti-ClpB e extratos de proteínas totais extraídos de células de A. baumannii - ATCC19606 crescidas em temperatura fisiológica (37C) e em choque térmico a 45C e choque térmico extremo a 50C. (B) O gráfico mostra os níveis relativos da proteína ClpB evidenciada na membrana de nitrocelulose em (A) quantificada por densitometria.
Quando as células de A. baumanni foram tratadas com o antibiótico estreptomicina (cepa ATCC 19606) ou com ampicilina + subactam e meropenem (cepa multirresistente a antibiótico RS4), pode-se verificar um evidente aumento na expressão da proteína ClpB sugerindo que esta chaperone também está envolvida com a resposta a estresse causado com antibióticos de grupos diversos, aminoglicosídeos, beta-lactâmicos e carbapênicos (Figura 3).



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