Caesalpinia ferrea



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DESENVOLVIMENTO DE MEMBRANAS E HIDROGÉIS COM EXTRATO AQUOSO E ETANÓLICO DE CAESALPINIA FERREA E SEUS POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS ASSOCIADOS AO ALGINATO COMO COADJUVANTES NO TRATAMENTO DE QUEIMADURAS

1*A.P. Cunha, 1R.R. Almeida, 1A.C.B. Ribeiro, 1C. P. Oliveira, 1E.C.C. Gomes, 1N. M. P. S. Ricardo, 2T.M. de Souza, 2D.F. Farias, 2A.F.F. Carvalho, 2G.P.G. de Lima, 2C.C. de Oliveira, 2M.P. Viana.

*E-mail: arcelinapacheco@yahoo.com.br



1Depto. de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil

2Laboratório de Bioprospecção em Recursos Regionais, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil

RESUMO:


As queimaduras são as causas mais comuns de lesões cutâneas. Para dinamizar o processo de cicatrização são utilizados polímeros naturais em substituição aos polímeros sintéticos. A pectina e a galactomanana de jucá (Caesalpinia ferrea) e o alginato reticulado com cálcio são atóxicos e biodegradáveis. E juntamente com os extratos dos frutos do jucá apresentaram propriedades bactericidas e toxicidade baixa, agem nas feridas promovendo a regeneração tecidual. A proposta desse trabalho é desenvolver membranas e hidrogéis com polissacarídeos naturais e bioativos existentes nos extratos vegetais que reúnam propriedades curativas em queimaduras. Os polissacarídeos isolados, membranas e hidrogéis foram caracterizados por Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho (FTIR), Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM), as propriedades Reológicas e bioensaios. E os extratos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). As membranas e hidrogéis de polímeros naturais com extratos de jucá se apresentaram como interessantes coadjuvantes à cicatrização em lesões dérmicas.

Palavras-chave:Membranas,hidrogéis, bioativos e queimaduras

  1. INTRODUÇÂO

As queimaduras são agressões físicas desencadeadas por lesões ao tecido de revestimento do organismo, que podem ser oriundas de agentes térmicos, químicos e elétricos. Muitas composições poliméricas têm sido utilizadas em queimaduras, principalmente os hidrogéis e membranas. Os polissacarídeos são polímeros naturais, constituídos de unidades básicas chamadas de monossacarídeos. Os polissacarídeos possuem uma ampla aplicação, especialmente nas áreas de alimentos, biomédica, farmacêutica e de cosméticos. Os polissacarídeos com aplicações industriais são extraídos de plantas, incluindo as algas, de animais e fungos ou são obtidos por processo de fermentação microbiológica. Nas plantas superiores estes podem ser obtidos de exsudatos, sementes, frutos e tubérculos. (1) O alginato é um polissacarídeo linear composto de β-D ácido manurônico e α-L ácido gulurônico unidos por ligações glicosídicas (1→4) e distribuídos em diferentes combinações dos monômeros ao longo da cadeia polimérica. Na medicina, o alginato de cálcio é muito usado na engenharia de reparação do tecido por meio do encapsulamento de células (2), curativos dérmicos e géis cicatrizantes. A pectina é também um polissacarídeo linear, mas formado pela união de ácidos D-galacturônicounidos em α-(1→4) em toda a cadeia, podendo apresentar interações com monossacarídeos, principalmente a raminose. Dependendo da fonte de extração da pectina, as proporções desses monossacarídeos agregados à cadeia polimérica, sofrem variações.(3) Decorrente do método de extração, o grau de metoxilação pode variar, dando pectinas de alta metoxilação e de baixa metoxilação. As galactomananas são obtidas principalmente de endosperma de sementes de plantas, encontradas em maiores quantidades nas sementes da família Leguminosae.(4) As galactomananas são assim denominadas por apresentarem como estrutura genérica, uma cadeia linear de resíduos de manose unidas por ligações glicosídicas -(14) e resíduos de galactose unidos por ligações do tipo -(16). A proporção de Manose:Galactose varia entre 1,1 a 4:1 nas diferentes espécies. Além das diferentes proporções Man:Gal, podem apresentar diferentes massas moleculares e estruturas finas e solubilidade em água depende do conteúdo de galactose substituinte; assim mananas, por exemplo, que não apresentam substituição, são insolúveis em água.(4) Os extratos de jucá têm se mostrado eficazes como antitumorais devido à ação comprovada de dois bioativos presentes: o ácido gálico e o metil gálico isolados dos frutos de Caesalpinia férrea mart.(5) O extrato aquoso de jucá não apresenta embriotoxicidade, não afetando a reprodução em cobaias. (6) O extrato hidro metanólico bruto de jucá contém antraquinonas, alcalóides, flavanóides, lactonas, saponinas, açúcar, taninos, sesquiterpenos e triterpenos, sendo os taninos majoritários. Por conter polifenóis, o extrato hidrometanólico bruto de jucá apresenta ação antimicrobiana bem superior ao antibiótico clorexidina, que é usado contra Streptococcus mutans, S. salivarius, S. oralise Candida albicans.(7) Ferimentos por queimaduras podem apresentar infecções oportunistas causadas por organismos do gênero candidae bactérias do gênero streptococus, Stafilococuse Pseudomonas, entre outros.(8) O ingresso de polímeros em forma de hidrogéis e membranas aparecem como terapêutica opcional e viável na busca de reparar os danos sofridos pelo pacientes queimados. Compete uma investigação sobre a possibilidade de usar as membranas e os Hidrogéis com bioativos de plantas na busca de uma regeneração tecidual.

  1. METERIAIS E MÉTODOS

2.1 Registro botânico (Caesalpinia férrea Mart ex Tul.Var Férrea)

O material foi coletado no Campus do Pici, da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE. Os detalhes do registro são: identificador: Prof. Dr. Edson Paulo Nunes, Departamento de Biologia da UFC, Herbário Prisco Bezerra. Registro: N° da exsicata 44695. Nome: Caesalpinia ferrea Mart. exTul.Var Férrea da Família das Fabaceae-caes, Sub família Caesalpinoidea e gênero Caesalpinia conhecido popularmente como jucá.



2.2 Preparação dos extratos dos frutos do Jucá para incorporação nas membranas e hidrogéis.

O método de extração aquosa, etanólica e metanólica dos extratos de jucá estão de acordo com as metodologias seguidas.(7),(9) Após extração o material foi liofilizado e calculado o rendimento.



2.3 Identificação e quantificação dos metabólitos secundários dos extratos de jucá

A pesquisa dos metabólitos secundários foi realizada através de testes de prospecção fitoquímica de acordo com a metodologia estudada.(10) Foram efetuados testes químicos com extrato aquoso,etanólico e metanólico dos frutos de jucá, para verificar a presença de metabólicos secundários. Para identificação e quantificação dos constituintes fenólicos presentes nos extratos, foram submetidos à análise em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE-UV e as quantidades das substâncias contidas em cada extrato foram determinadas por meio de cálculos comparativos com as curvas de calibração. A análise em CLAE-UV foi realizada por meio de um aparelho de HPLC Shimadzu (Japão, Kyoto), bomba LC-10AD Shimadzu (Japão, Kyoto) com sistema duplo de pistão, detector Photodio de Array SPD-M10A Shimadzu (Japão, Kyoto) e a coluna Phenomenex Luna C18 (5μ) 250 x 4,6 mm. As condições cromatográficas foram: Fase móvel Acetonitrila 15% e solução de ácido fórmico (0,1%) 85%; vazão de 1mL/min; comprimento de onda de 254 nm e tempo de corrida de 30 minutos.



2.4 Isolamento, purificação e caracterização dos polissacarídeos de jucá

A pectina foi extraída pelo método tradicional.(11) Em seguida, foram acrescidos aos sobrenadantes 1:3 de etanol PA, para separação e lavagem da pectina. O precipitado foi filtrado a vácuo, ressolubilizado e dializado. Posteriormente foi liofilizado para retirada do rendimento. Para a extração da galactomanana foram utilizados 10g do endosperma liofilizado e solubilizado com 900 mL de água destilada. O material foi mantido em chapa aquecedora numa temperatura de 75°C por 4 hora. Logo após, o material foi filtrado e o resíduo descartado. Ao filtrado adiciona-se etanol (1:3) para precipitação da galactomanana. O precipitado foi liofilizado e calculado o rendimento. (12)



2.5 Preparação dos hidrogéis, membranas e solução isolada dos extratos

As membranas foram preparadas através da dissolução de quantidades de pectina na proporção de 50% (m/m) e cloreto de cálcio (Vetec) 50% (m/m) do alginato de sódio (Aldrich) à temperatura de 55 ºC. Cada hidrogel foi preparado, na proporção, 1g de polissacarídeo purificado, acrescidos ou não de 10% do extrato em 150 mL de solvente. As soluções de extratos foram de 0,1% do extrato em água destilada.



2.7 Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho (FTIR)

Utilizaram-se para análise de infravermelho, cerca de 1 mg do polissacarídeo isolados para composição da pastilha de KBr. Foi realizada uma pressão de 8 toneladas na prensagem para composição da pastilha. A análise foi realizada num equipamento Perkin Elmer, modelo 16 PC.



2.8 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Foram realizadas análises de Microscopia Eletrônica de Varredura das superfícies dos polissacarídeos isolados. As análises foram feitas no Microscópio Eletrônico de Varredura, modelo Vega XMV Tescan.



2.9 Estudos reológicos dos hidrogéis

O estudo reológico das soluções aquosas dos polissacarídeos de jucá foi realizado às concentrações de 0,2; 0,6 e 1%. O estudo reológico foi realizado em reômetro da TA Instruments modelo AR 550, com um sensor do tipo cone-placa (diâmetro de 40 mm), fluxo contínuo de 0,1 a 1000 s-1 e freqüência de 0,1 Hz à 25ºC.



2.10 Teste de toxicidade aguda em camundongos dos extratos e membranas

O ensaio de avaliação da toxicidade aguda em camundongos dos extratos aquoso, etanólico e metanólico de jucá; Membranas (alginato de sódio, alginato/pectina e galactomananas) e os polissacarídeos isoladamente foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Vasconcelos(8), com modificações. As amostras foram administradas via injeção intraperitonial (0,3 mL. 10 g-1 de peso corpóreo) nas doses de 25, 50, 100, 150 e 200 mg. Kg-1 de peso corpóreo. Foram utilizados camundongos machos Swiss com peso médio entre 20 a 25 g, obtidos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (Biocen-UFC). Após 72 h da inoculação das amostras em diferentes concentrações, foram contados os indivíduos mortos, caso tenha ocorrido, para calcular medidas de dispersão como média, desvio padrão e coeficiente de variação. Foi utilizado como controle negativo uma solução de NaCl 0,9 %.



2.11 Avaliação do efeito das membranas e hidrogéis em feridas dérmicas experimentais.

Foram utilizados 24 ratos machos da raça Wistar de idade adulta e peso corpóreo médio de 203 g a 157g. Os animais foram mantidos isolados em gaiolas apropriadas e receberam ração e água ad libitum. Os animais foram anestesiados com doses adequadas de Cloridrato de ketamina 10% e cloridrato de xilazina 2%, de acordo com peso do animal. Ampla tricotomia era feita na região do dorso do animal, em seguida submetida à anti-sepsia com álcool iodado a 2% e proteção com campos cirúrgicos estéreis. Posteriormente, com um molde de polipropileno especificamente confeccionado; a pele é esticada de modo a evitar a formação de pregas. O molde é apoiado sobre a pele, para a demarcação da área de 2 cm2, isto feito, o molde era retirado para a realização da incisão, cortando assim um segmento quadrado da pele para posterior aplicação na ferida aberta do medicamento pretendido, de acordo com o grupo selecionado. Os animais foram divididos aleatoriamente em oito grupos de três membros. O grupo 1: controle com trofodermin creme (bactericida para aplicação tópica de amplo espectro); Grupo 2: tratados com solução salina ( NaCl a 0,9%); Grupo 3: aplicação da membrana de galactomanana (GMM); Grupo 4; aplicação do hidrogel de galactomanana (GMG); Grupo 5: aplicação da membrana com alginato e pectina (AlgPecM); grupo 6: aplicação de hidrogel de pectina (PecG); Grupo 7: aplicação do Hidrogel de galactomanana e extrato etanólico de jucá (GMExtG); Grupo 8: extrato etanólico de jucá (Ext). O período de medidadas das feridas, pesagem, tricotomia e tratamento era realizado a cada 4 dias, até completar 20 dias de experimento. A limpeza das gaiolas era feita diariamente para manter o local asseado e livre dos dejetos dos animais. As lesões de dois cm2 eram mensuradas através de um paquímetro Digital Caliper Within 300 mm, com precisão de 0,01mm e por meio deste avaliados o comprimento e largura da lesão. Todo o procedimento foi realizado de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA. O protocolo utilizado está de acordo com os padrões éticos estabelecidos pelo comitê de ética em pesquisa com animais da Universidade Federal do Ceará.



3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com a metodologia indicada(9) para análise qualitativa de fitoquímicos nos extratos de jucá, mostrou a presença de Taninos pirogálicos, flavonóis, flavononas, catequinas e alcalóides para todos os extratos analisados, estando de acordo com (10) que constatou a presença de flavonóides e taninos nos frutos de jucá. Através dos cromatogramas, foi realizado uma quantificação, pela integração dos pico correspondentes aos ácido elágico e gálico que revelaram teores desses ácidos no extrato de acetato de etila superiores ao extrato metanólico. Para o extrato metanólico foi obtido 1,72% de ácido gálico e 2,01% de ácido elágico. Para o extrato acetato de etila foi obtido 2,49% de ácido gálico e 5,89% de ácido elágico. O resultado dos rendimentos em porcentagem após isolamento e purificação dos polissacarídeos foi de 8% para a pectina e 67% para galactomananas . A prospecção de galactomananas é muito mais viável devido o grande rendimento obtido pela sua extração. De acordo com a análise dos espectros de FTIR da amostra de pectina foram observadas bandas referentes à impressão digital (abaixo de 2000 cm-1) de pectinas extraídas de outros vegetais. (13) Segundo alguns autores, a impressão digital de pectinas seria em torno de 1300 a 800 cm-1.(14) Para outros(15), essa região seria entre 1200 a 950 cm-1 específico para polissacarídeos ( pectina e galactomananas). Por meio dos dados espectrais de infravermelho, observou-se a integridade dos materiais com a obtenção de pectina e galactomananas (Fig. 01) de Caesalpinia ferrea .



Figura 01. Espectros de infravermelho dos polissacarídeos de jucá: pectina (à esquerda) e galactomanana ( à direita).



O método de secagem por liofilização se mostrou eficiente para o armazenamento e integridade dos polímeros. Através das micrografias se evidencia um aspecto fibrilar para galactomananas em solução concentrada e um aspecto esponjoso para pectina (Fig. 02). O tipo de biomaterial que se deseja elaborar está vinculado à concentração e a viscosidade dos biopolímeros.



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