Bioquímica



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Bioquímica

EBG / EA

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P1. Exercícios de Pipetagem
A grande maioria dos protocolos utilizados na Biologia Molecular faz uso de volumes muito pequenos de ácidos nucleicos, proteínas e / ou reagentes. Torna-se, portanto, necessário o uso de micropipetas capazes de medir volumes na ordem do µl (1 µl = 10-6 litros).
1.1. Exercícios de micropipetagem: uso da P20 (1-20 µl)
a) Use uma caneta de acetato para marcar três tubos de microcentrífuga (eppendorf ou equivalente).

b) Use o quadro seguinte para adicionar as várias soluções a cada tubo:




Tubo

sol. I

sol. II

sol. III

sol. IV

A

3µl

5µl

2µl

0µl

B

4µl

5µl

0µl

1µl

C

2µl

3µl

2µl

3µl

c) Prepare a micropipeta para o volume indicado e junte à solução I a cada tubo de reacção.


d) Use uma ponta nova para adicionar o volume apropriado do solvente II aos tubos de reacção A, B, C.
e) Use uma ponta nova para adicionar cada nova solução aos tubos.
f) Agite os tubos de modo a misturar os reagentes convenientemente.
g) Centrifugue na microcentrífuga uns 10 a 20 segundos.
h) Um total de 10 µl de reagentes foi adicionado a cada tubo. Para verificar que as suas medidas estavam correctas, regule a pipeta para 10 µl e lentamente pipete a solução de cada tubo para a ponta amarela da pipeta. Verifique que o volume pipetado está correcto; caso contrário, recomece uma nova série de pipetagens.

1.2. Exercícios de micropipetagem: uso da P200 (20-200µl) e P1000 (200-1000 µl)
a) Use uma caneta de acetato para marcar três tubos de microcentrífuga (eppendorf ou equivalente).
b) Use o quadro seguinte para adicionar as várias soluções a cada tubo:


Tubo

sol. I

sol. II

sol. III

sol. IV

E

100µl

200µl

150µl

550µl

F

150µl

250µl

350µl

250µl

c) Um total de 1000 µl deverá ter sido adicionado a cada tubo. Para verificar que a pipetagem foi correcta, regule a P1000 para 1000µl e lentamente pipete a solução de cada tubo para a ponta azul da pipeta.


P2. Electroforese horizontal submersa.

Determinação do tamanho de fragmentos de ADN obtidos por digestão enzimática

2.1. Introdução
O advento da Biologia Molecular só foi possivel com uma sucessão de descobertas em relação à estrutura e função de várias biomoléculas que constituiem as células, tecidos e organismos. Entre estas biomoléculas destaca-se o ácido desoxirribonucleico (ADN), o material genético da esmagadora maioria dos seres vivos, à excepção de algumas estirpes virais, cujos genes encontram-se codificados por uma forma – por vezes modificada – de ácido ribonucleico (ARN).
Um evento fundamental que possibilitou a clonagem, amplificação e manipulação de material genético foi a descoberta de que certas bactérias (Escherichia coli, por exemplo) têm um sistema de “restrição” enzimático para impedir a “invasão” de material genético estranho, seja ele viral (infecção) ou bacteriano (transformação / transdução). Estas “enzimas de restrição” mostravam uma especificidade até então desconhecida – isto é, endonucleases que só digeriam ADN se determinadas sequencias nucleotídicas estivessem presentes no ácido nucleico. Simultaneamente, vários grupos de cientistas começaram a estudar pequenas formas de ADN extracromossómicas com capacidade de auto-replicação, frequentemente denominadas por “plasmídios”.
Esta aula prática tem por objectivo o uso de enzimas de restrição de modo a digerir um plasmídio, contendo um gene de interesse, e determinar o seu mapa de restrição. Este é um dos primeiros passos para caracterizar o material genético que se vai estudar.


2.2. AVISOS
Antes de se iniciar esta aula prática, tenham em atenção o seguinte:
1) O brometo de etídio é um composto considerado altamente mutagénico e, por conseguinte, potencialmente cancerígeno. O uso de luvas é obrigatório no manuseamento de material (por ex., géis de agarose) que contenham este composto. O despejo de restos de agarose contendo brometo de etídio no esgoto ou lixo normal deve ser evitada. Em caso de dúvida, perguntem ao responsável pelas aulas práticas.
2) A luz ultravioleta é perigosa, em particular para os olhos. O uso de óculos de protecção é obrigatória na visualização do gel após a separação dos fragmentos. Recomenda-se também o uso de uma máscara em vez dos óculos de protecção.

2.3. Digestão de ADN por enzimas de restricão:
O plasmídio utilizado nestas aulas práticas é o pBSK2-A3LacZ que contém a região promotora de um gene para a actina que regula a expressão do gene reporter LacZ (Fig. 1). De modo a determinar o mapa de restrição deste plasmídio, prepare as seguintes amostras:


Tubo

ADN

10 x tampão

PstI

BamHI

H20

1

1µl

1,5µl

1µl

-

11,5µl

2

1µl

1,5µl

-

1µl

11,5µl

3

1µl

1,5µl

1µl

1µl

10,5µl



Fig 1 - Diagrama esquemático do plasmídio pBSK2-A3LacZ. pA3, região promotora do gene para a actina a montante do gene reporter LacZ.


2.4. Preparação de um gel de 1% de agarose:
1. Preparar o molde, colocando fita-cola e pente.
2. Adicionar a agarose a um tampão adequado (1 x TAE) num erlenmeyer adequado.
3. Aquecer a suspensão no microondas (controlar o aquecimento de modo a evitar o transvase da solução).
4. Adicionar brometo de etídio para uma concentração final de 0.2 µg ml-1.
5. Quando a temperatura tiver descido de tal modo que permita o contacto da mão com o erlenmeyer, verter sobre o molde de forma contínua. Eliminar todas as bolhas que eventualmente se tenham formado durante o enchimento do molde.
6. Deixar gelificar à temperatura ambiente.
7. Retirar o pente, tendo o cuidado de não provocar roturas nos poços.

2.5. Preparação da tina de electroforese:
1. Encher a tina com tampão de electroforese (1 x TAE).
2. Colocar o gel de modo a que fique completamente imerso. Evitar o excesso de tampão, porém, pois quanto mais tampão tiver acima do nível do gel, mais lentamente decorrerá a separação dos fragmentos de ADN.
2.6. Aplicação das amostras e marcadores:
1. Para cada amostra misturar:
- 13,5 µl de amostra; a

- 1,5 µl de corante (10x) contendo azul de bromofenol (migra com fragmentos de ADN de cerca de 5 kb) e cianol de xileno (migra com fragmentos de cerca de 0.5 kb).


2. Amostras a deitar nos poços do gel:
- fago  digerido por HindIII; e

- amostras 1 ( x PstI), 2 ( x BamHI) e 3 ( x PstI x BamHI ).



2.7. Electroforese:
1. Com a fonte de alimentação desligada, estabelecer as ligações correctas. Ligar o cátodo (-) ao terminal eléctrico mais próximo da extremidade do gel que contém os poços.
2. Utilize uma corrente contínua entre 60-100 mA, dependendo do gel, da tina de electroforese e do tampão utilizado.
3. Depois da conclusão da electroforese, visualize os resultados sob luz ultravioleta (ler a secção 2.2 AVISOS, s.f.f).
4. Determine o tamanho das bandas no gel e construa o mapa de restrição do plasmídio.








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