AplicaçÃo da metodologia ddrt-pcr na identificaçÃo de genes diferencialmente expressos em cianobactérias martens, Stefani Betina Boschmann; figueiredo



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Rio Grande/RS, Brasil, 23 a 25 de outubro de 2013.


APLICAÇÃO DA METODOLOGIA DDRT-PCR NA IDENTIFICAÇÃO DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS EM CIANOBACTÉRIAS
MARTENS, Stefani Betina Boschmann; FIGUEIREDO, Márcio de Azevedo; ALMEIDA, Daniela Volcan; LANES, Carlos Frederico Ceccon; ABREU, Paulo César Vergne; MARINS, Luis Fernando Fernandes

Orientador: MARINS, Luis Fernando Fernandes

stefanimartens@hotmail.com
Evento: Congresso de Iniciação Científica

Área do conhecimento: Biologia Molecular
Palavras-chave: cianobactérias, expressão gênica, PCR
1 INTRODUÇÃO
A metodologia DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcription - PCR) (Liang & Pardee, 1992) foi desenvolvida com a intenção de prover uma ferramenta efetiva para detectar espécies de RNA individuais que são expressos diferencialmente em distintos tipos celulares. Este método pode ser usado para identificação de qualquer gene expresso diferencialmente (Kuhn, 2001) e permite a determinação de perfis de transcrição com base qualitativa ou semi-quantitativa (Rahmanm et al., 2003).

Desde sua introdução, centenas de aplicações têm sido descritas utilizando a DDRT-PCR. Entretanto, poucos estudos têm utilizado esta técnica para a identificação de genes diferencialmente expressos em procariontes. Neste sentido, o presente trabalho teve por objetivo aplicar a DDRT-PCR na cianobactéria Synechocystis sp. da coleção FURG/PETROBRAS como modelo procarionte.


2 MATERIAIS E MÉTODOS
Esta cepa tem como característica principal a resistência à água de produção de petróleo (AP) diluída a 50%. Com o intuito de detectar os genes que se expressam diferencialmente na cianobactéria exposta à AP 50% em comparação com os controles cultivados em meio H2, foram utilizados 20 oligonucleotídeos arbitrários para a realização de reações de PCR. Amostras de cDNA fita dupla foram previamente sintetizadas a partir de RNA total extraído dos cultivos e utilizadas como molde para as PCRs. Os perfis de expressão foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, de onde os transcritos diferencialmente expressos foram isolados, purificados, clonados e sequenciados.
3 RESULTADOS e DISCUSSÃO
De onze transcritos isolados, apenas dois (AB1 e AB17) foram sequenciados com sucesso. O transcrito AB1 teve 474 nucleotídeos sequenciados e a análise da sequência através da ferramenta BLASTX do GenBank apontou para uma identidade de 98% com o fator de elongação Tu 2 (tuf-2) de bactérias do gênero Aeromonas. A mesma análise foi realizada com 676 nucleotídeos do transcrito AB17. Neste caso, observou-se uma identidade de 69% com o domínio de ligação ao NAD (dinucleotídeo de nicotinamida-adenina) de bactérias do gênero Aurantimonas. A identificação de genes bacterianos pela DDRT-PCR sugere a presença de outros microorganismos nos cultivos. Para testar esta hipótese, alíquotas dos cultivos foram plaqueadas em meio sólido. O resultado deste experimento comprovou a presença não somente de bactérias, mas também de fungos em associação com a cianobactéria (Fig. 1).
Figura 1. Crescimento em meio sólido de alíquotas dos cultivos, demonstrando a contaminação por bactérias e fungos.

Os resultados aqui obtidos demonstram que a DDRT-PCR foi capaz de detectar transcritos procariontes diferencialmente expressos e que é provável que a resistência à água de produção de petróleo pode não depender apenas das cianobactérias, mas de uma associação simbiótica com bactérias e fungos trabalhando sinergicamente para a detoxificação da água de produção de petróleo.


4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Através dos experimentos concluímos que o método se mostrou eficaz para identificação de genes diferencialmente expressos, mas como o meio não era estéril possivelmente houve a identificação de genes que não eram da microalga em estudo. Ainda que os genes identificados não tenham sido da microalga, a resistência à água de produção de petróleo pode não depender apenas das cianobactérias, mas de uma associação simbiótica com bactérias e fungos trabalhando sinergicamente para a detoxificação da água de produção de petróleo.
REFERÊNCIAS
Liang, P., Pardee, A.B. 1992. Differential display of eucaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257, 967-971.

Kuhn, E. 2001. From Library Screening to Microarray technology: Strategies to determine gene expression profiles and to identify differentially regulated genes in plants. Ann. Bot. 87, 139-155.



Rahmanm, M.M., Vandingenen, A., Begum, M., Breuer, M., De Loof, A., Huybrecht, R. 2003. Search for phase specific genes in the brain of desert locustae Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae) by differential display polymerase chain reaction. Comp. Biochem. Physiol., Part A Mol. Integr. Physiol. 135(2), 221-228.



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