Análise da variabilidade genética de proles de Rhamdia quelen



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Análise da variabilidade genética de proles de Rhamdia quelen provenientes de fertilização artificial com sêmen fresco e criopreservado
Herivelto Beck de Souza(PIBIC/Fundação Araucária/Unioeste), Marcio Douglas Goes, Elenice Souza dos Reis Goes, Robie Allan Bombardelli, Thaís Souto Bignotto(Orientador), e-mail: thais.bignotto@unioeste.br
Universidade Estadual do Oeste do Paraná/Centro de Engenharias e Ciências Exatas/Toledo-PR
Grande área e área: Ciências Agrárias - Zootecnia
Palavras-chave: jundiá, microssatélites, reprodução artificial
Resumo
O objetivo da presente proposta foi avaliar a variabilidade genética, por meio de marcadores microssatélites, de proles de Rhamdia quelen obtidas por fertilização artificial utilizando sêmen fresco e sêmen criopreservado. Para isso, foram empregados pools de gametas de seis reprodutores (três fêmeas e três machos) para cada tratamento. Os quatro loci microssatélites analisados (Rhq2, Rhq15, Rhq20 e Rhq28) produziram um total de 23 alelos. Os índices de variabilidade genética foram adequados para ambos os sistemas, porém revelaram-se menores para o sistema com sêmen criopreservado (índice de Shannon= 1,47 e 1,32; diversidade genética= 0,739 e 0,693; heterozigosidade observada= 0,7090 e 0,5761; heterozigosidade esperada= 0,7399 e 0,6918, para sistemas com sêmen fresco e criopreservado, respectivamente). O coeficiente de endogamia Fis sugeriu deficiência de heterozigotos para ambos os sistemas reprodutivos, sendo mais expressivo no sistema com sêmen criopreservado. Desvios significativos no equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados para todos os loci.
Introdução
O jundiá (Rhamdia quelen) é uma espécie de peixe que possui facilidade de adaptação a diferentes ambientes e temperaturas, no manejo e na reprodução, além de ter boa aceitação no mercado consumidor. Outro fator de destaque é o domínio do processo reprodutivo da espécie em cativeiro (Bombardelli et al., 2006). As técnicas de reprodução artificial de peixes com sêmen fresco ou criopreservado são importantes para viabilizar alevinos em quantidade e qualidade necessárias e revela a possibilidade de limitar o estoque de machos na piscicultura. Contudo, apesar das boas perspectivas sobre estas tecnologias, as estratégias de manejo reprodutivo dos peixes podem reduzir os níveis de variabilidade genética das proles, podendo causar prejuízos. Marcadores moleculares de DNA constituem importante ferramenta na investigação de estratégias reprodutivas alternativas, na implantação de programas de melhoramento genético e no manejo reprodutivo. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a variabilidade genética, por meio de marcadores microssatélites, de proles de R. quelen provenientes de fertilização artificial empregando-se sêmen fresco e sêmen criopreservado.
Materiais e Métodos
Os procedimentos de reprodução artificial foram conduzidos no Instituto de Pesquisa em Aquicultura Ambiental da Unioeste, Campus de Toledo, em dezembro de 2014, e estão de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais da Unioeste (protocolo: 05099). Os reprodutores selecionados foram identificados, marcados por microchips, separados de acordo com o sexo e submetidos à manipulação hormonal conforme Baldisserotto & Gomes (2010). Previamente à manipulação reprodutiva, os peixes foram anestesiados em solução de benzocaína. A coleta dos gametas foi conduzida de acordo com Bombardelli et al. (2006). Pools de gametas de seis reprodutores (ovócitos de três fêmeas e sêmen de três machos) foram utilizados para as fertilizações artificiais, sendo que no primeiro tratamento foi empregado pool de sêmen fresco e, no segundo tratamento, pool de sêmen criopreservado. O sêmen fresco destinado a criopreservação foi preparado conforme Toledo et al. (2010). Em seguida, foi realizada a mistura dos gametas atendendo à dose inseminante da espécie (120.000 espermatozóides:ovócito), com posterior adição de água para ativação dos gametas. O material foi homogeneizado e transferido para incubadoras experimentais. Para análise da variabilidade genética, larvas de três a cinco dias de idade foram utilizadas para extração de DNA. Os primers para loci microssatélites para R. quelen, bem como as amplificações via PCR, foram descritos por Ríos et al. (2013). Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 10% e corados com nitrato de prata. Os índices de variabilidade genética das proles foram obtidos com os programas Popgene 1.32 e Fstat 2.9.3.2.
Resultados e Discussão
Os quatro loci microssatélites analisados foram altamente polimórficos (100%) e produziram um total de 23 alelos. As frequências dos alelos apresentaram-se desiguais entre as proles de jundiá nos sistemas de reprodução artificial com sêmen fresco e criopreservado, sendo observados inclusive alelos de baixa frequência (menor que 0,100). Para o lócus Rhq28, foi observado ausência do alelo F no sistema com sêmen criopreservado. A riqueza alélica (na) foi maior que o número efetivo de alelos (ne) para todos os loci, confirmando a distribuição desigual das frequências alélicas com a presença de alelos de baixa frequência (Tabela 1). Moderada variabilidade genética foi observada dentro de cada grupo, como revelado pelos valores médios de índice de Shannon e de diversidade genética (Tabela 2). Ademais, esses valores foram menores para o sistema com sêmen criopreservado.

Tabela 1 Tamanhos dos alelos em pares de base (pb), número de alelos observados por lócus (na), número efetivo de alelos (ne) e frequência dos alelos (A, B, C, D, E, F e G) para proles de Rhamdia quelen obtidas por sistema de reprodução artificial empregando sêmen fresco ou criopreservado

Loci

pb

na

ne

Frequência

Sistema utilizando sêmen fresco

Rhq2

243-285

7

4,58

0,0854/0,2866/0,0244/0,1890/0,2866/0,0305/0,0976

Rhq15

150-179

6

4,59

0,2102/0,0114/0,2670/0,1989/0,2386/0,0739

Rhq20

217-253

4

2,87

0,2778/0,0667/0,1667/0,4889

Rhq28

165-210

6

3,66

0,0787/0,2865/0,0393/0,3876/0,0281/0,1798

Sistema utilizando sêmen criopreservado

Rhq2

243-285

7

3,72

0,0114/0,3807/0,0455/0,0966/0,2955/0,0114/0,1591

Rhq15

150-179

6

3,82

0,0732/0,0488/0,3537/0,3232/0,1463/0,0549

Rhq20

217-253

4

3,03

0,3920/0,0170/0,2670/0,3239

Rhq28

165-200

5

2,58

0,0915/0,2805/0,0061/0,5427/0,0793/0,0000


Tabela 2 Índice de Shannon (IS), diversidade genética (DG), heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He), coeficiente de endogamia (Fis) e teste de probabilidade para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (PHW) calculados para proles de R. quelen provenientes de reprodução artificial com sêmen fresco ou criopreservado

Locus

IS

DG

Ho

He

Fis

PHW

Sistema utilizando sêmen fresco

Rhq2

1,665

0,787

0,6463

0,7865

0,1731

0,0000*

Rhq15

1,587

0,787

0,7159

0,7869

0,0850

0,0000*

Rhq20

1,185

0,654

0,8222

0,6552

-0,2618

0,0000*

Rhq28

1,462

0,731

0,6517

0,7309

0,1034

0,0161*

média

1,47±0,21

0,739

0,7090

0,7399

0,0361

-

Sistema utilizando sêmen criopreservado

Rhq2

1,488

0,736

0,4886

0,7350

0,3314

0,0000*

Rhq15

1,512

0,744

0,5488

0,7429

0,2567

0,0005*

Rhq20

1,154

0,673

0,8523

0,6736

-0,2724

0,0031*

Rhq28

1,139

0,617

0,4146

0,6159

0,3226

0,0000*

média

1,32±0,20

0,693

0,5761

0,6918

0,1624

-

Valor Negativo de Fis = perda de homozigose (Weir e Cockerham, 1984); *(P≤0,01)
A heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) variou de 0,4146 (Rhq28) a 0,8523 (Rhq20) e de 0,6159 (Rhq28) a 0,7865 (Rhq2), respectivamente (Tabela 2). Novamente, foram observados menores valores médios de Ho e He para o sistema com sêmen criopreservado. O coeficiente de endogamia Fis apresentou valores positivos para a maioria dos loci, indicando endogamia e deficiência de heterozigotos em ambos os sistemas reprodutivos, sendo mais expressivo no sistema reprodutivo com sêmen criopreservado. Desvios significativos no equilíbrio de Hardy-Weinberg foram observados para todos os loci (Tabela 2), o que pode ser explicado pelos desvios dos valores de Ho e He nos dois sistemas reprodutivos. Este fato é esperado em estoques mantidos em cativeiro, já que os desvios nas frequências podem ser provocados por deriva genética, causando redução da variabilidade genética (Lopera-Barrero et al., 2014).
Conclusões
Os resultados obtidos no presente trabalho revelaram adequada variabilidade genética para as proles de Rhamdia quelen obtidas por meio de reproduções artificiais. No entanto, os índices de variabilidade genética foram menores no sistema reprodutivo com sêmen criopreservado.
Agradecimentos
À Fundação Araucária, pela concessão da bolsa de estudos; ao Grupo de Pesquisas em Recursos Pesqueiros e Limnologia; ao Instituto de Pesquisa em Aquicultura Ambiental; ao Núcleo de Pesquisa PeixeGen da Universidade Estadual de Maringá.
Referências
Baldisserotto, B. & Gomes, L.C. (2010). Espécies nativas para a piscicultura no Brasil. 2. ed. Santa Maria: UFSM. 608p.
Bombardelli, R.A.; Mörschbächer, E.F.; Campagnolo, R.; Sanches, E.A. & Syperreck, M.A. (2006). Dose inseminante para fertilização artificial de ovócitos de jundiá cinza, Rhamdia quelen (Quoy & Gaimardm, 1824). Revista Brasileira de Zootecnia, 35, 1251-1257.
Lopera-Barrero, N.M.; Alvarez, C.A.R; Rodriguez-Rodriguez, M.P; Povh, J.A.; Vargas, L.; Streit Júnior, D.P.; Sirol, R.N. & Ribeiro, R.P. (2014). Diversidade genética e paternidade de progênies de Brycon orbignyanus obtidas por diferentes sistemas reprodutivos. Semina: Ciências Agrárias 35, 541-554.
Ríos, N.; Bouza, C.; Pardo, B.G.; Guerra-Varela, J.; Gutierrez, V.; Martinez, P. & García, G. (2013). Pyrosequencing for microsatellite discovery and validation of markers for population analysis in the non-model Neotropical catfish Rhamdia quelen. Molecular Ecology Resources 13, 546-549.
Toledo, C.P.R.; Neumann, G.; Tessaro, L.; Krause, R.A.; Bombardelli, R.A. (2010). Resfriamento e criopreservação de sêmen de jundiá cinza (Rhamdia quelen) diluído em diferentes soluções. In Anais do XIX Encontro Anual de Iniciação Científica, Guarapuava, Paraná, Brasil.






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