AdsorçÃo de albumina de soro bovino em filmes finos nanoestruturados de tiO2, Nb2O



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ADSORÇÃO DE ALBUMINA DE SORO BOVINO EM FILMES FINOS NANOESTRUTURADOS DE TiO2, Nb2O5 E ZrO2
Denise A. Tallarico1, Angelo L. Gobbi2, Pedro I. Paulin Filho3, Marcelo E. H. Maia da Costa4, Anouk Galtayries5, Pedro A. P. Nascente3

1Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos (SP), Brasil

2Laboratório Nacional de Nanotecnologia, Campinas (SP), Brasil

3Departamento de Engenharia de Materiais, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos (SP), Brasil

4Departamento de Física, Pontifícia Universidade Católica - Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ), Brasil

5Laboratoire de Physico-Chimie des Surfaces, Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Paris, Paris, França

E-mail: deniseboni@yahoo.com.br


Resumo.
Titânio, nióbio e zircônio possuem grande potencialidade para o uso como materiais de implantes devido à combinação de biocompatibilidade, boas propriedades mecânicas, estabilidade térmica e ótima resistência à corrosão. A compreensão da biocompatibilidade, que é fortemente influenciada pela adsorção de proteínas na superfície, é muito importante para o aperfeiçoamento dos implantes. Neste trabalho, titânio, nióbio e zircônio foram depositados por pulverização magnética catódica a uma elevada taxa de oxigênio a fim de obter filmes finos totalmente oxidados. A composição química, morfologia e propriedades mecânicas foram analisadas por espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS), espectrometria de massa de íons secundários por tempo de vôo (ToF-SIMS), microscopia de força atômica (AFM) e nanoindentação. Os filmes finos foram recobertos com diferentes concentrações de albumina de soro bovino (BSA) e foram analisados por AFM e ToF-SIMS. Os espectros de XPS mostraram que as superfícies dos filmes são compostas de TiO2, Nb2O5 e ZrO2. As imagens de AFM mostraram que todos os filmes possuem tamanhos de grão nanoestruturados e baixa rugosidade. A dureza e o módulo de elasticidade para os filmes foram mensurados e a maior dureza foi obtida para o filme de ZrO2 (14,5 GPa) e o filme de Nb2O5 apresentou o menor modulo elástico (95 GPa). As imagens ex situ de AFM mostraram a conformação da BSA e moléculas e aglomerados de proteína foram observados. A conformação das moléculas adsorvidas foi diferente para cada uma das superfícies. Os resultados de AFM e ToF-SIMS mostraram que a BSA possui uma maior afinidade com a superfície de ZrO2 e uma menor afinidade com a superfície de TiO2.
Palavras-chave: Albumina de soro bovino, Titânio, Zircônio, Nióbio.

1. INTRODUÇÃO
De todos os materiais estudados e desenvolvidos para utilização em aplicações biomédicas, os metais continuam sendo os biomateriais mais apropriados para substituição do osso e da cartilagem devido, principalmente, às suas propriedades mecânicas.

Implantes cirúrgicos são normalmente feitos de três tipos de materiais: aços inoxidáveis austeníticos, ligas cobalto-cromo-molibdênio e titânio e suas ligas. A escolha desses metais é baseada em propriedades como estabilidade química e biológica e resistência mecânica.

Quando um biomaterial é implantado, as proteínas adsorvem imediatamente sobre a sua superfície. A resposta do tecido aos materiais implantados surge principalmente das diferenças na adsorção das proteínas que, por sua vez, dependem de parâmetros de superfície, composição química, rugosidade e carga de superfície, entre outras.

Os fenômenos físico-químicos que ocorrem na superfície da interface osso/implante determinam as respostas biológicas após a implantação dos biomateriais e, portanto, são fundamentais para a eficácia do processo de osseointegração. Entretanto, alguns biomateriais com propriedades mecânicas adequadas (ductilidade, tenacidade à fratura, módulo elástico e resistência à tração, compressão, flexão, fadiga, torção e ao cisalhamento) não possuem um bom desempenho em algumas características de superfície importantes para aplicações clínicas como, por exemplo, a não citotoxicidade e a resistência à corrosão em meio fisiológico.

A resistência à corrosão é uma propriedade importante dos materiais metálicos utilizados em implantes ortopédicos e odontológicos, pois determina a vida útil do dispositivo, mas também é importante por causa da nocividade dos produtos de corrosão, que podem ser liberados e, em seguida, interagir com os organismos vivos.

Dentre os materiais utilizados atualmente, e que possuem propriedades mecânicas adequadas, porém apresentam citotoxicidade, podemos citar: as ligas de cobalto-cromo, aços inoxidáveis e ligas titânio-alumínio-vanádio, que geram efeitos adversos no organismo do paciente devido à toxicidade dos íons liberados. As ligas mais utilizadas atualmente são as de titânio-alumínio-vanádio (Ti-6Al-4V) e o aço inoxidável AISI 316L, sendo que este último é o mais utilizado no Brasil.

A ampla utilização do aço AISI 316L é devida a uma combinação de facilidade de processamento, propriedades mecânicas adequadas e principalmente baixo custo quando comparado a outros implantes. O sistema único de saúde (SUS) é o maior responsável pela utilização de aço em implantes, pois, enquanto as próteses de aço são fabricadas no Brasil a um preço médio de 1200 reais, as de outros materiais são importadas a um preço médio de 9 mil reais. No entanto, testes comparativos entre o aço inoxidável 316L e as outras ligas utilizadas para este fim mostraram que a resistência contra a corrosão é menor no aço, sendo mais facilmente atacado pelos fluidos corpóreos, ricos em íons cloreto.

Como a produção e uso dos materiais citados anteriormente já estão bem consolidados, uma opção para a adequação destes materiais é a modificação de suas superfícies por meio da deposição de um filme fino metálico produzido com metais não citotóxicos e que possuam melhor resistência à corrosão em meio fisiológico. Estudos revelaram que existem cinco elementos não citotóxicos: nióbio, zircônio, tântalo, platina e titânio. Destes metais podemos destacar o titânio, nióbio e zircônio como potenciais candidatos devido à combinação de apropriada biocompatibilidade, propriedades mecânicas adequadas e ótima resistência à corrosão. O bom desempenho em experimentos in vivo demonstrado por estes materiais é devido, principalmente, à camada de óxido formada em ar ou em ambiente salino. Como consequência, esta camada de óxido diminui a taxa de corrosão, minimizando a liberação de íons metálicos para o meio biológico e facilitando a osseointegração, levando a uma ótima biocompatibilidade e baixa toxicidade.

Uma técnica de deposição de filmes finos que vem sendo estudada para uso em implantes é a pulverização catódica ou sputtering, um processo industrial utilizado com sucesso para estender o tempo de vida útil de componentes industriais e que parece promissor para a área biomédica.

Uma das grandes vantagens deste método é a possibilidade de produzir filmes finos nanoestruturados. Superfícies nanoestruturadas são interessantes quando se trata da interface osso/implante porque as partículas geradas pelo desgaste natural de implantes nanoestruturados não são imunorreativas e, portanto, são menos prejudiciais no corpo humano que as partículas de desgaste de implantes convencionais.



Este trabalho teve como objetivo a produção de filmes finos nanoestruturados de TiO2, Nb2O5, ZrO2, pelo método de sputtering, para a avaliação dessas superfícies nos recobrimentos de implantes. Para tanto, as propriedades químicas, morfológicas e mecânicas de cada filme fino foram testadas e avaliadas. A fim de aferir o comportamento destes materiais em meio fisiológico, foram analisados os contatos destas superfícies com a albumina de soro bovino (BSA), uma importante proteína conhecida por inibir a adesão de plaquetas e a formação de trombos.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Deposição dos filmes finos
Os filmes finos dos óxidos de Ti, Nb e Zr foram depositados sobre substratos de Si(111) por pulverização magnética catódica (DC magnetron sputtering) a partir de alvos dos elementos puros Ti, Nb e Zr (pureza de 99,9%, diâmetro de 6 mm e espessura de 3 mm). Os substratos foram mecanicamente fixados ao catodo do sistema convencional de DC magnetron sputtering (Balzers BA510) e uma mistura de 20% vol. de oxigênio e 80% vol. de argônio (99,999% de pureza) foi utilizada como gás de sputtering. A separação alvo-substrato foi de 0,26 m. Os filmes foram depositados nas condições de 150 W de potência do catodo e de 4 x 10-5 Pa de base de pressão de vácuo. A espessura dos filmes foi de 500 nm.
2.2 Microscopia de Força Atômica
A morfologia das superfícies dos filmes finos foi determinada utilizando um microscópio de força atômica comercial (MultiMode 8 Bruker AXS). O instrumento foi operado em modo de contato intermitente e foram obtidas imagens de áreas de 1 x 1 µm2 e 500 x 500 nm2. Por meio do programa NanoScopeAnalysis foi possível obter os valores da rugosidade média (Ra) e do tamanho de grão.
2.3 Espectrometria de massa de íons secundários por tempo de vôo
A composição química das superfícies e as distribuições químicas do perfil das amostras foram determinadas utilizando a técnica ToF-SIMS. As analises foram realizadas utilizando um espectrômetro TOF-SIMS V (ION-TOF GmbH) com a seguinte configuração: a câmara de análise foi mantida em menos de 5 x 10-7 Pa em condições de operação, o fluxo de íons primária total foi inferior a 1012 íons x cm-2 para garantir condições estáticas. Para o feixe de análise foi usado um feixe pulsado de íon primário de Bi + (Ion Gun Liquid Metal, LMIG), com energia de 25 keV e corrente de cerca de 1 pA sobre uma área de 100 x 100 μm2. Os valores exatos da massa de pelo menos seis espécies conhecidas, a partir de H-, C-, O-, C2-, C3- e Cl-, foram utilizadas para a calibração dos dados adquiridos no modo de íons negativos. A erosão iônica (sputtering) foi realizada utilizando 2 keV de um feixe de íons de Cs+ com uma corrente de 90 nA sobre uma área de 300 x 300 μm2. A aquisição dos dados e as análises foram realizadas utilizando o programa comercial IonSpec ©.
2.4 Espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X
As análises de XPS foram realizadas sob ultra-alto vácuo (10-7 Pa) empregando um espectrômetro Thermo Electron ESCALAB 250 com uma fonte monocromática de raios X de Al Kα (hν = 1486,6 eV). O espectrômetro foi calibrado com as energias de ligação de referência (BEs) das amostras de Cu (Cu 2p3/2 a 932,6 eV), Ag (Ag 3d5/2 a 368,2 eV) e Au (Au 4f7/2 a 84,0 eV).

A área analisada teve um diâmetro de cerca de 500 μm. Além do espectro exploratório, foram obtidos também os espectros de alta resolução de: C 1s, O 1s, Ti 2p, Nb 3d e Zr 3d com um ângulo de 90°. Os efeitos de carregamento eletrostático na superfície foram minimizados utilizando-se o pico de C 1s (do carbono adventício do ambiente rico em hidrocarbonetos) como padrão a uma energia de ligação de 285 eV. As análises dos dados foram realizadas empregando-se o programa CasaXPS ©.


2.5 Nanoindentação
Os ensaios de nanoindentação foram feitos empregando-se um nanoindentador TriboIndenter (Hysitron, Inc.), utilizando um penetrador triangular piramidal Berkovich de diamante. Cada amostra foi testada em temperatura ambiente e as medições foram feitas em profundidades de penetração extremamente pequena. A análise estatística dos valores obtidos com a sequência de nanoindentações permitiu obter os valores da dureza (H) e do módulo elástico (E). Para eliminar qualquer influência do substrato nos valores obtidos para os filmes finos, a faixa de penetração do penetrador foi limitada a uma profundidade menor do que 0,3 d, onde d é a espessura do filme.
2.6 Adsorção de BSA sobre as superfícies dos óxidos
A deposição de BSA sobre as superfícies das amostras foi feita em condições próximas às fisiológicas (pH 7,4 e 37ºC). A BSA foi obtida pela empresa Sigma-Aldrich. Ela possui um peso molecular de 66 kg/mol (66 kDa) e pureza de 98%. Esta proteína foi dissolvida em água ultrapura (2 g/L). Esta solução (solução estoque) foi armazenada a 4 ºC. A fim de se aproximar das condições fisiológicas, a solução estoque foi diluída em uma solução tampão fosfato-salino (PBS - phosphate buffered saline), constituída de 0,01 M de fosfato, de 0,0027 M de KCl e de 0,137 M de NaCl. Este tampão possui um pH de 7,4 e foi fornecido pela Sigma-Aldrich. Foram obtidas as seguintes concentrações de BSA: 20 µg/ml e 100 µg/ml.

Para cada série de concentração foi repetido o mesmo procedimento: a superfície do filme fino foi recoberta com a solução de proteína e levada a uma estufa de temperatura constante de 37 °C por 1 h (para reprodução da temperatura corpórea humana). O filme fino foi então colocado à temperatura ambiente e sua superfície recebeu uma quantidade de PBS suficiente para recobrir todo o filme fino (a fim de remover a BSA não adsorvida) que ficou em contato com a superfície por 10 min. Em seguida, todo o líquido foi retirado com a ajuda de uma pipeta. Então, nova solução de PBS foi adicionada à superfície e deixada em contato por 10 min. Este procedimento foi realizado três vezes para cada filme fino analisado. As amostras secas foram guardadas ao abrigo da luz e em temperatura ambiente controlada (27 ºC).



3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Caracterização morfológica dos filmes finos sem recobrimento de proteína por AFM
A rugosidade e a morfologia das superfícies dos filmes de Ti, Nb e Zr depositados sobre os substratos de Si(111) foram caracterizadas por AFM e as imagens podem ser vistas nas figuras 1, 2 e 3 respectivamente. Nessas figuras é possível observar a baixa rugosidade e os tamanhos nanométricos dos grãos.

Figura 1. Imagem 2D obtidas no modo não contato para o filme de Ti (500 x 500 nm2).

Figura 2 Imagem 2D obtidas no modo não contato para o filme de Nb (500 x 500 nm2).

Figura 3 Imagem 2D obtidas no modo não contato para o filme de Zr (500 x 500 nm2).
A análise das imagens por meio de um programa específico forneceu os valores da rugosidade (Ra) e do tamanho de grão dos filmes. Estes dados estão apresentados na tabela 1. De acordo com os valores observados na tabela 1, todos os filmes apresentaram tamanhos de grão nanoestruturados.
Tabela 1 Valores das rugosidades e tamanhos de grão para todos os filmes.

Filme fino

Rugosidade Ra (nm)

Tamanho de grão (nm)

Ti

0,20

17

Nb

0,17

13

Zr

1,10

35


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